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谷-胱甘肽還原酶(GR)測(cè)試盒 生化試劑

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谷-胱甘肽還原酶(GR)測(cè)試盒,是一種黃素酶,每分子酶蛋白含有一分子的 FAD。由輔酶 NADPH 供氫,催化氧化型谷-胱甘肽(GSSG),還原成還原型谷-胱甘肽(GSH)。

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谷-胱甘肽還原酶(GR)測(cè)試盒

50 /48 樣)

一、測(cè)定意義:

谷-胱甘肽還原酶(Glutathione Reductase)是一種黃素酶,

每分子酶蛋白含有一分子的 FAD。由輔酶 NADPH 供氫,

催化氧化型谷-胱甘肽(GSSG),還原成還原型谷-胱甘肽

GSH)。還原型谷-胱甘肽(GSH)可使含巰基(-SH)的

酶處于還原狀態(tài)及活性狀態(tài),維持紅細(xì)胞膜的完整性,防止

血紅蛋白氧化。

GR 定位于微粒體及細(xì)胞液部分。因各臟器的組織細(xì)胞

普遍含有 GR,因而 GR 在機(jī)體的氧化還原反應(yīng)中起了舉足

輕重的地位。

二、測(cè)定原理:

氧化型谷-胱甘肽(GSSG)在谷-胱甘肽還原酶 GR 的催

化下,由 NADPH 供氫,使 GSSG 還原生成還原型谷-胱甘肽

(GSH)后,GSH 增加,NADPH 減少。在 340nm 處可檢測(cè)到

NADPH 的吸光度值的下降。

三、試劑組成:(50 /48 樣)

試劑一:60mL×2 瓶,4℃保存 6 個(gè)月。

試劑二:粉劑×4 支,

4℃保存 6 個(gè)月;用時(shí)每支加雙蒸水 1mL

充分溶解后備用,4℃保存。

試劑三:粉劑×2 支,

4℃保存 6 個(gè)月;用時(shí)每支加雙蒸水 1mL

充分溶解后備用,-20℃以下保存。

工作液的配制:按試劑一︰試劑二︰試劑三=23006030

的比例進(jìn)行配制,用多少配多少,現(xiàn)用現(xiàn)配,余下

4℃保存 45 天(使用前在 37℃預(yù)溫 5 分鐘)。

四、血清(漿)中 GR 活力的測(cè)定:

1、血清(漿)樣本前處理:

血清不需要離心;血漿要 20003000 轉(zhuǎn)/分,離心 8 分鐘。

2、血清(漿)中 GR 活力測(cè)定的操作過(guò)程:

①、紫外分光光度計(jì) 340nm 處,1cm 光徑石英比色皿

用雙蒸水調(diào)零;(石英比色皿準(zhǔn)備兩只,一只用于調(diào)零,

一只用于測(cè)定)

②、往相應(yīng)編號(hào)的試管中加入 50μL 新鮮血清(漿),吸取

工作液 2.4mL 沖入試管中,快速混勻,并計(jì)時(shí);

③、迅速倒入石英比色皿中,紫外分光光度計(jì),340nm

比色,30 秒時(shí)讀取吸光度值 A1

④、將此反應(yīng)液倒入原試管中置 37℃準(zhǔn)確水浴 2 分鐘,再

迅速倒入石英比色皿中,

2 30 秒時(shí)讀取吸光度值 A2

⑤、求出 2 次吸光度差值(A=A1-A2)。

[]:第一次讀數(shù)時(shí)的時(shí)間可以不固定(20 秒、40 秒等都可

以,但不要太長(zhǎng)),只要讀 A1 A2 之間的時(shí)間差為

2 分鐘即可;如果 A1 A2 值接近,可以增加樣本體

積,或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間(如 5min 10min)。

3、血清(漿)中 GR 的計(jì)算:

①、血清(漿)中 GR 的活力單位定義:

每升血清(漿)每分鐘使反應(yīng)體系中底物 NADPH

的濃度改變 1mM 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

6.22 NADPH 340nm 波長(zhǎng) 1cm 光徑的消光系數(shù)。

d:比色光徑,1cm;

T:反應(yīng)時(shí)間,2min;

V :取樣量,0.05mL。

五、組織勻漿中 GR 活力的測(cè)定:

1、組織樣本的前處理:

準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g:體積(mL=1:9

比例,加入 9 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下機(jī)械勻漿,

制成 10%的組織勻漿,2500 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,取上清

液待測(cè)

2、組織中 GR 活力測(cè)定的操作過(guò)程:

①、紫外分光光度計(jì) 340nm 處,1cm 光徑石英比色皿

用雙蒸水調(diào)零;(石英比色皿準(zhǔn)備兩只,一只用于調(diào)零,

一只用于測(cè)定)

②、往相應(yīng)編號(hào)的試管中加入 20μL 組織勻漿上清液,吸取

工作液 2.4mL 沖入試管中,快速混勻,并計(jì)時(shí);

③、迅速倒入石英比色皿中,紫外分光光度計(jì),340nm

比色,30 秒時(shí)讀取吸光度值 A1;

④、將此比色液倒入原試管中置 37℃準(zhǔn)確水浴 2 分鐘,再

迅速倒入石英比色皿中

2 30 秒時(shí)讀取吸光度值 A2;

⑤、求出 2 次吸光度差值(A=A1-A2)。

[]:第一次讀數(shù)時(shí)的時(shí)間可以不固定(20 秒、40 秒等都可

以,但不要太長(zhǎng)),只要讀 A1 A2 之間的時(shí)間差為

2 分鐘即可;如果 A1 A2 值接近,可以選擇更大的

樣本濃度,或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間(如 5min 10min)。

3、組織勻漿中 GR 活力單位的計(jì)算:

①、組織勻漿中 GR 活力單位的定義:

每克組織蛋白每分鐘使反應(yīng)體系中底物 NADPH

濃度改變 1mM 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

6.22 NADPH 340nm 波長(zhǎng) 1cm 光徑的消光系數(shù)。

d:比色光徑,1cm

T:反應(yīng)時(shí)間,2min;

V :取樣量,0.05mL;

N:樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

Cpr:組織勻漿蛋白濃度,gprot/mLprot 指蛋白)

谷-胱甘肽還原酶(GR)測(cè)試盒

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