ATP 含量測(cè)試盒(化學(xué)發(fā)光法) 生化試劑
- 型 號(hào):
- 參考價(jià):0~0
ATP 含量測(cè)試盒(化學(xué)發(fā)光法),是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體, 其含量的變化直接關(guān)系到各器官的能量代謝。
ATP 含量測(cè)試盒(化學(xué)發(fā)光法)
(貨號(hào):A095-2 200T 化學(xué)發(fā)光法)
一、測(cè)定意義:
三磷酸腺苷(Adenosine 5'-triphosphate,ATP)是生物
體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體, 其含量的變化直接關(guān)系到各
器官的能量代謝。ATP 作為最重要的能量分子在細(xì)胞的各
種生理、病理過(guò)程中起著重要作用。ATP 水平的改變,會(huì)
影響許多細(xì)胞的功能。通常細(xì)胞在凋亡、壞死或處于一些
毒性狀態(tài)下,ATP 水平會(huì)下降,而高葡萄糖刺激等對(duì)于一
些細(xì)胞可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi) ATP 水平。通常 ATP 水平的下降
表明線粒體的功能受損或下降,在細(xì)胞凋亡時(shí) ATP 水平的
下降通常和線粒體的膜電位下降同時(shí)發(fā)生。
二、測(cè)試原理:
本試劑盒根據(jù)螢火蟲(chóng)熒光素酶(Firefly Luciferase)催
化熒光素產(chǎn)生熒光時(shí)需要 ATP 提供能量研制而成。當(dāng)螢火
蟲(chóng)熒光素酶和熒光素都過(guò)量時(shí),在一定的濃度范圍內(nèi)熒光
的產(chǎn)生和 ATP 的濃度成正比。這樣就可以高靈敏地檢測(cè)溶
液中的 ATP 濃度。
本試劑盒在樣品體積為 100μL 時(shí)可以檢測(cè)濃度低達(dá)
1nmol/L 的 ATP。而常規(guī)的細(xì)胞或組織裂解液中 ATP 的濃
度僅為 0.1- 1μmol/L,一些常見(jiàn)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi) ATP 水平約
為 10nmol/mg 蛋白。
四、保存條件:
-20℃保存 6 個(gè)月。-80℃可保存一年。底物酶貯備液
需避光保存。
五、樣本前處理:
1、貼壁細(xì)胞:
吸除培養(yǎng)液,按照 6 孔板每孔加入 200μL 裂解液裂解
細(xì)胞。裂解細(xì)胞時(shí)為了裂解充分,可以使用移液器進(jìn)行反
復(fù)吹打,或晃動(dòng)培養(yǎng)板使裂解液充分接觸并裂解細(xì)胞。通
常細(xì)胞在接觸裂解液后會(huì)立即裂解。裂解后 4℃,12000g
離心 5 分鐘,取上清,用于后續(xù)的測(cè)定。
2、懸浮細(xì)胞:
用離心管離心沉淀細(xì)胞,棄上清,輕輕彈散細(xì)胞,按
照 6 孔板每孔加入 200μL 裂解液裂解細(xì)胞。裂解細(xì)胞時(shí)為
了裂解充分,可以彈擊離心管管底,適當(dāng) Vortex 使裂解液
充分接觸并裂解細(xì)胞。通常細(xì)胞在接觸裂解液后會(huì)立即裂
解。裂解后 4℃,12000g 離心 5 分鐘,取上清,用于后續(xù)
的測(cè)定。
3、組織樣本:
按照每 20 毫克組織加入約 100-200μL 裂解液的比例加
入裂解液,然后用玻璃勻漿器或其它勻漿設(shè)備進(jìn)行勻漿。
充分勻漿可確保組織被裂解。裂解后 4℃,12000g 離
心 5 分鐘,取上清,用于后續(xù)的測(cè)定。
六、操作步驟
1、加 100μL 酶工作液到檢測(cè)孔或檢測(cè)管內(nèi)。室溫放置 3-5
分鐘,以使本底性的 ATP 全部被消耗掉,從而降低本
底??梢砸淮涡园?/span> 10-20 個(gè)檢測(cè)孔或檢測(cè)管分別加上
100μL 酶工作液,從而節(jié)省時(shí)間。
2、在檢測(cè)孔或檢測(cè)管內(nèi)加上 20 微升樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,迅速
用 槍 ( 微 量 移 液 器 ) 混 勻 , 至 少 間 隔 2 秒 后 , 用
Luminometer 或液閃儀測(cè)定 RLU 值或 CPM。
3、為了消除樣品制備時(shí)由于蛋白量的差異而造成的誤差,
可以用南京建成生產(chǎn)的蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品
中的蛋白濃度。然后把 ATP 的濃度換算成 nmol/mg 蛋
白的形式。
七、注意事項(xiàng):
1、酶貯備液中含有熒光素酶,反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致其逐漸失
活。建議使用時(shí)的凍融次數(shù)不宜超過(guò) 3 次。酶貯備液
稀釋成酶工作液后,最好一次用完,不宜凍存后再使
用。
2、ATP,特別是裂解后樣品中的 ATP 在室溫不太穩(wěn)定,
需在 4℃或冰上操作。ATP 在冰上可以穩(wěn)定達(dá) 6 小時(shí)。
3、本試劑盒需使用化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)。如果沒(méi)有
化學(xué)發(fā)光儀,也可以使用液閃儀。液閃儀的測(cè)定效果
取決于其檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)精度。
4、測(cè)定之前建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn),樣品的體積可以自行在
10-100μL 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。如果樣品中的 ATP 濃度比較低,
則可以加入 100μL 樣品,如果樣品中 ATP 濃度比較高,
則可以加入小體積的樣品,同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品也需要使用相
同的體積。如果樣品中 ATP 的濃度特別高,可以用裂
解液稀釋樣品后再測(cè)定。
5、使用可檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的多功能酶標(biāo)儀時(shí),所用 96 孔板
宜為孔和孔之間不透光的黑板或白板。如使用常規(guī)的
透明 96 孔板,需特別注意正確設(shè)置酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)板子
的類(lèi)型,同時(shí)也可以在檢測(cè)孔之間設(shè)置間隔孔,以盡
量避免鄰近孔之間的相互干擾。
6、本試劑盒提供的裂解液可以有效裂解并釋放常見(jiàn)的培
養(yǎng)細(xì)胞和組織中的 ATP。對(duì)于一些特殊的組織或樣品,
如果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出來(lái)的 ATP 水平顯著低于預(yù)期水平,可
以在裂解樣品后并且在離心前,取部分樣品煮沸 2 分
鐘以充分釋放 ATP。煮沸后樣品中的蛋白會(huì)變性,從
而會(huì)在后續(xù)的離心步驟中被沉淀,因此煮沸的樣品不
能用于蛋白濃度測(cè)定、SDS-PAGE 和 Western 檢測(cè)。可
以使用剩余的部分樣品進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定、SDS-PAGE
和 Western 檢測(cè)。
7、本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床
診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通
住宅內(nèi)。
8、為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操
作。
八、產(chǎn)品特點(diǎn):
1、適用范圍廣,本試劑盒可用于檢測(cè)組織、細(xì)胞中 ATP
含量。
2、靈敏度高,本試劑盒可檢測(cè) 1nmol/L 的 ATP。
3、樣本制備簡(jiǎn)單,本試劑盒提供了可以用于細(xì)胞和組織
裂解的裂解液,簡(jiǎn)單裂解后即可用于 ATP 檢測(cè)。無(wú)需
進(jìn)行高氯酸或三氯-乙-酸(TCA)抽提,煮沸等繁瑣操作。
4、穩(wěn)定性高,本試劑盒進(jìn)行了特殊的優(yōu)化設(shè)計(jì),使檢測(cè)
ATP 時(shí)的化學(xué)發(fā)光非常穩(wěn)定。對(duì)于 ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢
測(cè)結(jié)果顯示,在開(kāi)始反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)化學(xué)發(fā)光無(wú)明顯
下降,開(kāi)始反應(yīng)后 30 分鐘內(nèi)化學(xué)發(fā)光的下降不超過(guò)
10%。
5、測(cè)定多樣性,使用本試劑盒中的裂解液裂解獲得的細(xì)
胞或組織樣品,不僅可以用于 ATP 檢測(cè),還可用于檢
測(cè)蛋白濃度、進(jìn)行 SDS-PAGE 或一些常規(guī)的較易溶解
蛋白的 Western 檢測(cè)。
6、方便快捷,本試劑盒的使用方便快捷,通常 10-20 個(gè)
樣品可以在 30-60 分鐘內(nèi)測(cè)定完畢。
附錄 I:標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
1、標(biāo)準(zhǔn)品制備:
冰浴上溶解待用試劑,把 0.5mmol/L 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液
用裂解液稀釋成 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μmol/L
的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液,待測(cè)。
2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:
a、加 100μL 酶工作液到檢測(cè)孔內(nèi)。室溫放置 5 分鐘,以
使本底性的 ATP 全部被消耗掉,從而降低本底。
b、在檢測(cè)孔內(nèi)加上 20μL 標(biāo)準(zhǔn)品,迅速用微量移液器混勻,
間隔 2 秒后,用 Luminometer 測(cè)定 RLU 值。
ATP 含量測(cè)試盒(化學(xué)發(fā)光法)