堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒(微量酶標(biāo)法) 生化試劑
- 型 號(hào):
- 參考價(jià):0~0
堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒(微量酶標(biāo)法),分解磷酸苯二鈉,產(chǎn)生游離酚和磷酸,酚在堿性溶液中與 4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰-化鉀氧化生成紅色醌衍生物,根據(jù)紅色深淺可以測(cè)定酶活力的高低。
堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒(微量酶標(biāo)法)
(微量酶標(biāo)法)
一、測(cè)定原理:
堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉,產(chǎn)生游離酚和磷酸,酚在
堿性溶液中與 4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰-化鉀氧化生成紅色
醌衍生物,根據(jù)紅色深淺可以測(cè)定酶活力的高低。
三、樣本采集及保存:
1、按常規(guī)采集樣本, 樣本可以是血清、血漿(肝素抗凝為佳)、
細(xì)胞培養(yǎng)上清。組織或培養(yǎng)細(xì)胞(按實(shí)驗(yàn)方法學(xué)進(jìn)行樣本前
處理,然后進(jìn)行測(cè)定)。
2、如樣本收集后(如血清(漿)、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)上清等)
不能及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)將樣本放置于-20℃以下保存(溫度越低越
好)。
七、注意事項(xiàng):
1、 如果所用的酶標(biāo)儀沒(méi)有此波長(zhǎng),可以用相近的 510nm 或
者 530nm 波長(zhǎng)均可,且 510nm 波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果相對(duì) 530nm
更好。
2、 由于加樣量比較少,建議加樣時(shí)將吸頭靠近酶標(biāo)板底部,
緩慢加樣,邊加邊將吸頭上移,以保證吸頭上樣本殘留
量最少,減少加樣方面存在的誤差。
3、 所加試劑接近于水劑,所以對(duì)吸頭的黏附性很小,但加
試劑時(shí)還是需要注意,速度不宜太快,以免濺出酶標(biāo)孔
外。
4、 加樣或加試劑若靠壁加入則需靠近底部,前部分處理反
應(yīng)液量比較少,若靠近上端加樣則會(huì)有部分黏附于酶標(biāo)
孔上端。
5、 酶標(biāo)孔比較小,所以混勻力度要適中,太劇烈則可能將
液體濺出,太慢則混勻不充分;先將孔壁上的液體輕輕
的震動(dòng)落下,再前后、左右的搖動(dòng)。
6、 一般對(duì)于酶標(biāo)板可能存在初始吸光度的差異,最好在使
用之前先在相應(yīng)的波長(zhǎng)處測(cè)定其初始的吸光度,然后再
加樣測(cè)定。
7、 本試劑盒僅用于科研、實(shí)驗(yàn)室。
8、 正式實(shí)驗(yàn)前需要取 2 例預(yù)計(jì)差異的樣本進(jìn)行預(yù)試,
若酶活力過(guò)高可將其稀釋后測(cè)定 OD 值控制在 0.2 或 0.3
左右,若酶活力較低,則直接測(cè)定或加大一倍取樣量后
測(cè)定。
附錄Ⅲ: AKP 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
一、樣本前處理:
將標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用雙蒸水 50 倍,20 倍,10 倍,5 倍,2.5
倍,5/3 倍,1.25 倍稀釋及原液操作(濃度為 0.022 mg/mL、
0.055 mg/mL、0.11 mg/mL、0.22 mg/mL、0.44 mg/mL、0.66
mg/mL、0.88 mg/mL、1.1 mg/mL)
附錄Ⅳ: 培養(yǎng)液及培養(yǎng)細(xì)胞中 AKP 測(cè)定
一、樣本前處理:
1、細(xì)胞培養(yǎng)液:吸取培養(yǎng)液,1000-1500 轉(zhuǎn)/分鐘,離心 10 分鐘,
取上清液進(jìn)行測(cè)定。
2、培養(yǎng)細(xì)胞前處理:
①、培養(yǎng)細(xì)胞的收集:
懸浮培養(yǎng)細(xì)胞:可直接通過(guò)離心收集沉淀細(xì)胞(1000 轉(zhuǎn)/
分鐘,離心 10 分鐘,棄上清留沉淀細(xì)胞)
貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞:吸去上清,可通過(guò)細(xì)胞刮直接將細(xì)胞刮
下;或者是用 0.25%的胰-酶室溫消化 2~3 分
鐘,加培養(yǎng)液終止消化,用微量移液器輕輕
吹打,將所有液體吸出轉(zhuǎn)入 EP 管,然后 1000
轉(zhuǎn)/分鐘,離心 10 分鐘棄上清,留沉淀細(xì)胞,
再加入 1mL PBS 輕輕吹打,再次 1000 轉(zhuǎn)/分
鐘,離心 10 分鐘棄上清,留沉淀細(xì)胞待用。
如暫時(shí)不做,則可以將細(xì)胞沉淀物低溫凍存,
溫度越低越好。
②、培養(yǎng)細(xì)胞的破碎:
研磨破碎:在細(xì)胞沉淀中加入一定量(10 6的細(xì)胞一般加
0.3~0.5mL)的緩沖液(緩沖液可以用 PBS
或者是生理鹽水),用手動(dòng)玻璃勻漿器冰水浴
研磨 3~5 分鐘,或者是用卡富隆電動(dòng)研磨器
冰水浴研磨 3 分鐘待測(cè);
超聲破碎:在細(xì)胞沉淀中加入一定量(10 6 的細(xì)胞一般加
0.3~0.5mL)的緩沖液(緩沖液可以用 PBS
或者是生理鹽水),需保證超聲探頭在液面以
下。功率 300W,冰水浴,每 3~5S 超聲一次,
間隔 4 次(每次間隔時(shí)間為 30S 左右)
化學(xué)裂解:貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,可直接將上清吸去后,直接
在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液(覆蓋滿
細(xì)胞),裂解 30~40 分鐘(可用顯微鏡觀
察細(xì)胞破碎情況),再用微量移液器吸出待測(cè)。
根據(jù)需要可用生理鹽水或 PBS 進(jìn)行一定的稀
釋。
堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒(微量酶標(biāo)法)