堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒（微量酶標(biāo)法）

（微量酶標(biāo)法）

一、測(cè)定原理：

堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在

堿性溶液中與 4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰-化鉀氧化生成紅色

醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測(cè)定酶活力的高低。

三、樣本采集及保存：

1、按常規(guī)采集樣本, 樣本可以是血清、血漿（肝素抗凝為佳）、

細(xì)胞培養(yǎng)上清。組織或培養(yǎng)細(xì)胞（按實(shí)驗(yàn)方法學(xué)進(jìn)行樣本前

處理，然后進(jìn)行測(cè)定）。

2、如樣本收集后（如血清（漿）、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)上清等）

不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)將樣本放置于-20℃以下保存（溫度越低越

好）。

七、注意事項(xiàng)：

1、 如果所用的酶標(biāo)儀沒(méi)有此波長(zhǎng)，可以用相近的 510nm 或

者 530nm 波長(zhǎng)均可，且 510nm 波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果相對(duì) 530nm

更好。

2、 由于加樣量比較少，建議加樣時(shí)將吸頭靠近酶標(biāo)板底部，

緩慢加樣，邊加邊將吸頭上移，以保證吸頭上樣本殘留

量最少，減少加樣方面存在的誤差。

3、 所加試劑接近于水劑，所以對(duì)吸頭的黏附性很小，但加

試劑時(shí)還是需要注意，速度不宜太快，以免濺出酶標(biāo)孔

外。

4、 加樣或加試劑若靠壁加入則需靠近底部，前部分處理反

應(yīng)液量比較少，若靠近上端加樣則會(huì)有部分黏附于酶標(biāo)

孔上端。

5、 酶標(biāo)孔比較小，所以混勻力度要適中，太劇烈則可能將

液體濺出，太慢則混勻不充分；先將孔壁上的液體輕輕

的震動(dòng)落下，再前后、左右的搖動(dòng)。

6、 一般對(duì)于酶標(biāo)板可能存在初始吸光度的差異，最好在使

用之前先在相應(yīng)的波長(zhǎng)處測(cè)定其初始的吸光度，然后再

加樣測(cè)定。

7、 本試劑盒僅用于科研、實(shí)驗(yàn)室。

8、 正式實(shí)驗(yàn)前需要取 2 例預(yù)計(jì)差異的樣本進(jìn)行預(yù)試，

若酶活力過(guò)高可將其稀釋后測(cè)定 OD 值控制在 0.2 或 0.3

左右，若酶活力較低，則直接測(cè)定或加大一倍取樣量后

測(cè)定。

附錄Ⅲ： AKP 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

一、樣本前處理：

將標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用雙蒸水 50 倍，20 倍，10 倍，5 倍，2.5

倍，5/3 倍，1.25 倍稀釋及原液操作（濃度為 0.022 mg/mL、

0.055 mg/mL、0.11 mg/mL、0.22 mg/mL、0.44 mg/mL、0.66

mg/mL、0.88 mg/mL、1.1 mg/mL）

附錄Ⅳ： 培養(yǎng)液及培養(yǎng)細(xì)胞中 AKP 測(cè)定

一、樣本前處理：

1、細(xì)胞培養(yǎng)液：吸取培養(yǎng)液，1000-1500 轉(zhuǎn)/分鐘，離心 10 分鐘，

取上清液進(jìn)行測(cè)定。

2、培養(yǎng)細(xì)胞前處理：

①、培養(yǎng)細(xì)胞的收集：

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：可直接通過(guò)離心收集沉淀細(xì)胞（1000 轉(zhuǎn)/

分鐘，離心 10 分鐘，棄上清留沉淀細(xì)胞）

貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞：吸去上清，可通過(guò)細(xì)胞刮直接將細(xì)胞刮

下；或者是用 0.25%的胰-酶室溫消化 2～3 分

鐘，加培養(yǎng)液終止消化，用微量移液器輕輕

吹打，將所有液體吸出轉(zhuǎn)入 EP 管，然后 1000

轉(zhuǎn)/分鐘，離心 10 分鐘棄上清，留沉淀細(xì)胞，

再加入 1mL PBS 輕輕吹打，再次 1000 轉(zhuǎn)/分

鐘，離心 10 分鐘棄上清，留沉淀細(xì)胞待用。

如暫時(shí)不做，則可以將細(xì)胞沉淀物低溫凍存，

溫度越低越好。

②、培養(yǎng)細(xì)胞的破碎：

研磨破碎：在細(xì)胞沉淀中加入一定量（10 6的細(xì)胞一般加

0.3～0.5mL）的緩沖液（緩沖液可以用 PBS

或者是生理鹽水），用手動(dòng)玻璃勻漿器冰水浴

研磨 3～5 分鐘，或者是用卡富隆電動(dòng)研磨器

冰水浴研磨 3 分鐘待測(cè)；

超聲破碎：在細(xì)胞沉淀中加入一定量（10 6 的細(xì)胞一般加

0.3～0.5mL）的緩沖液（緩沖液可以用 PBS

或者是生理鹽水），需保證超聲探頭在液面以

下。功率 300W，冰水浴，每 3～5S 超聲一次，

間隔 4 次（每次間隔時(shí)間為 30S 左右）

化學(xué)裂解：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接將上清吸去后，直接

在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液（覆蓋滿

細(xì)胞），裂解 30～40 分鐘（可用顯微鏡觀

察細(xì)胞破碎情況），再用微量移液器吸出待測(cè)。

根據(jù)需要可用生理鹽水或 PBS 進(jìn)行一定的稀

釋。

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