NADPH-細胞-色素c還原酶(NCR)試劑盒 生化試劑
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NADPH-細胞-色素c還原酶(NCR)試劑盒,是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員,催化氧化型P450還原再生。
NADPH-細胞-色素c還原酶(NCR)試劑盒
(貨號:A132-1-1 NADPH-Cytochrome-c Reductase, 分光光度法 50T/48樣)
一、測定意義:
細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代
謝。NCR作為P450酶系的重要一員,催化氧化型P450還原再生。
二、測定原理:
NCR催化NADPH還原氧化型細胞-色素c,還原型細胞-色素c在550nm處有獨-特吸收峰;通過測定550nm吸光度的增
加速率,來計算NCR活性。
三、需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、普通離心機、超速離心機、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水
四、試劑的組成和配制:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入100mL 蒸餾水充分溶解。
試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入2.60mL 蒸餾水充分溶解,4℃保存。
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入550μL 蒸餾水充分溶解,4℃保存。
五、粗酶液提?。?/span>
① 稱取約0.5g組織,加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一,冰上充分研磨,10,000g,4℃離心30min,取上清液轉(zhuǎn)移到超速
離心管中;
② 在4℃,100,000g離心60min,棄上清液;
③ 在沉淀中加入1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100,000g離心30min,棄上清液;
④ 向上步驟沉淀中加入0.5mL試劑二,蓋緊后充分震蕩溶解,4℃保存待測。
六、測定步驟:
1、 分光光度計預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長至550nm,蒸餾水調(diào)零;
2、 試劑二在37℃水浴預(yù)熱30min以上;
3、 樣本測定
(1)空白管:取1mL玻璃比色皿,一次加入50μL蒸餾水、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四,迅速
混勻后于550nm處分別測定第10s吸光值A(chǔ)1和第130s吸光值A(chǔ)2,計算ΔA空白=A2-A1。(每批樣本只需做一個空白管)
(2)測定管:取1mL玻璃比色皿,一次加入50μL粗酶液、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四,迅速
混勻后于550nm處分別測定第10s吸光值A(chǔ)3和第130s吸光值A(chǔ)4;計算ΔA測定=A4-A3。
七、NCR 活力單位的計算
1、按照蛋白濃度的計算:
單位定義:37℃反應(yīng)條件下,每mg蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細胞-色素c定義為1U;
NCR(U/mg prot)=(ΔA測定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
= 529×(ΔA測定-ΔA空白)÷ Cpr
2、按樣本質(zhì)量計算:
單位定義:37℃反應(yīng)條件下,每g樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細胞-色素c定義為1U;
NCR(U/g)=(ΔA測定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 265×(ΔA測定-ΔA空白)÷W
ε:還原型細胞色素c在550nm處摩爾吸光系數(shù)為1.91×10 4L/mol/cm=0.0191 L/μmol/cm;
d:比色皿光徑(cm),1cm;
V反總:反應(yīng)體系總體(L),1010μL=1.01×10 -3L;
Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;
V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),50μL=0.05mL;
V樣總:加入提取液體積(mL),0.5mL;
T:催化反應(yīng)時間(min),2min;
W:樣本質(zhì)量,(g)。
NADPH-細胞-色素c還原酶(NCR)試劑盒