糖原(Glycogen)測(cè)定試劑盒 生化試劑
- 型 號(hào):
- 參考價(jià):0~0
糖原(Glycogen)測(cè)定試劑盒,在濃硫酸的作用下可脫水生成糖醛衍生物,后者再與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物,與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液比色定量。
糖原(Glycogen)測(cè)定試劑盒
(比色法)
一、測(cè)定原理:
糖原(Glycogen)在濃硫酸的作用下可脫水生成糖醛衍
生物,后者再與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物,與同法處理的標(biāo)
準(zhǔn)葡萄糖溶液比色定量。糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定,故在
顯色之前先將組織放入濃堿中加熱以破壞其它成分而保留糖
原。
二、試劑組成與配制:(50 管/48 樣)
試劑一:堿溶液,40mL×1 瓶,室溫或 2~8℃保存 6 個(gè)月。
試劑二:1mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液,1mL×1 支,室溫或 2~
8℃保存 6 個(gè)月。臨用前將 1mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品貯
備液∶雙蒸水=1∶99 的比例混合配成 0.01mg/mL 葡
萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,現(xiàn)用現(xiàn)配,當(dāng)天有效。
試劑三:顯色劑,粉劑×6 支,室溫或 2~8℃保存 6 個(gè)月。用
時(shí)每支加濃硫酸 25mL(濃硫酸自備),混勻,現(xiàn)用
現(xiàn)配。
顯色劑配制的注意點(diǎn):
1、濃硫酸濃度必須 95%-98%的分析純并且不可開瓶太久
(開瓶放置太久,濃度會(huì)降低)。
2、配制顯色劑的容器和量筒必須絕對(duì)干燥,否則會(huì)使試劑
三無法充分溶解。
3、配制顯色劑時(shí):先將粉劑倒入燒杯中,然后加少量濃硫
酸(約 10mL),用玻棒壓碎粉劑,使其充分溶解,然
后再加入剩余的濃硫酸,充分?jǐn)嚢韬笫覝乇芄獗4妗?/span>
三、樣本前處理:
1、組織樣本處理:
① 取樣:取組織樣本(如肝臟或肌肉)用生理鹽水漂洗后,濾
紙吸干,稱重(樣本重量≤100mg 為宜,不要>100mg)。
② 水解:按樣本重量(mg)∶堿液體積(μL)=1∶3,一起加
入試管中,沸水浴煮 20min,流水冷卻。
例如:肝臟組織稱重 75mg 按重量體積比 1∶3 應(yīng)加入堿
液的量為 225μL;肌肉組織稱重 85mg 按重量體積
比 1∶3 應(yīng)加入堿液的量為 255μL。
③ 將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測(cè)液:
肝糖原檢測(cè)液為 1%,加雙蒸水的量為:肝臟重量×100 - 肝
臟重量×4*=肝臟重量×96
肌糖原檢測(cè)液為 5%,加雙蒸水的量為:肌肉重量×20 - 肌
肉重量×4*=肌肉重量×16
注:4*為水解時(shí)堿液與組織的體積數(shù)。
例如上例:制備 1%肝糖原檢測(cè)液,加雙蒸水的量為:
75×96=7200μL =7.2 mL;制備 5%肌糖原檢測(cè)液,加雙蒸水
的量為:85×16=1360μL =1.36mL。
2、細(xì)胞樣本前處理:
① 細(xì)胞沉淀的收集(細(xì)胞數(shù)量在 100 萬(wàn)個(gè)以上):
⑴、對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,直接取細(xì)胞懸液,1000rpm/分鐘
離心 10 分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。
⑵、對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,用胰-酶將細(xì)胞消化下來,或用細(xì)
胞刮將細(xì)胞刮下來,制成細(xì)胞 懸液,1000rpm/分鐘 離
心 10 分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。
② 細(xì)胞沉淀的洗滌:
在細(xì)胞沉淀中加入 0.5~1mL的緩沖液(0.1mol/L pH7~
7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水), 輕輕混勻,1000rpm/分
鐘離心 10 分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。
③ 水解:
⑴ 破碎后水解(適用于未知細(xì)胞數(shù)量或者細(xì)胞數(shù)量差異
較大的樣本):細(xì)胞沉淀加入 0.2~0.5mL 緩沖液(0.1mol/L
pH7~7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水),冰水浴條件下超聲
破碎或手動(dòng)勻漿,不離心,直接取樣(取出部分測(cè)總蛋白
濃度,總蛋白濃度測(cè)定試劑盒本所有售,推薦 A045-3/-4,
BCA 法總蛋白測(cè)定試劑盒)0.05mL 加入堿溶液 0.15mL,
沸水浴 20 分鐘,流水冷卻,即為糖元檢測(cè)液。
⑵ 不破碎直接水解(適用于細(xì)胞總數(shù)相近或不考慮細(xì)胞
總數(shù)的樣本):每管中加入堿溶液 0.225mL,沸水浴 20 分
鐘,流水冷卻,加雙蒸水 0.225mL,即為糖元檢測(cè)液。
附錄Ⅰ:脂肪肝樣本糖原測(cè)定
一、樣本前處理:
1、取樣:取新鮮肝臟樣本用生理鹽水漂洗后,濾紙吸干,稱
重(樣本重量≤100mg 為宜,不要>100mg)。
2、水解:按樣本重量(mg)∶堿液體積(μL)=1∶3,一起
加入試管中,沸水浴煮 20min,流水冷卻。
3、將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測(cè)液:
肝糖原檢測(cè)液為 5%,加雙蒸水的量為:
肝臟重量×20 - 肝臟重量×4*=肝臟重量×16
注:4*為水解時(shí)堿液與組織的體積數(shù)。
4、檢測(cè)液除脂:取上述制備好的檢測(cè)液(一般可見檢測(cè)液上
層漂浮有乳白色油狀物),加入一定量的氯仿,可
按照檢測(cè)液量(mL):氯仿(mL)=4:1,漩渦混勻,3500
轉(zhuǎn)/分鐘離心 10 分鐘,取上清用于測(cè)定(如含量較高,
需稀釋后再測(cè)定)。
糖原(Glycogen)測(cè)定試劑盒