液體樣本甘油酶法測定試劑盒 生化試劑
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液體樣本甘油酶法測定試劑盒,與游離脂肪酸一樣,甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測指標,但檢測更加方便。
液體樣本甘油酶法測定試劑盒
描述:甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。脂蛋白酯酶能夠水解血
液中的甘油三酯;胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯;激素
敏感脂肪分解酶能夠水解脂肪細胞中的甘油三酯。與游離脂
肪酸一樣,甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測指標,
但檢測更加方便。本試劑盒采用甘油磷酸氧化酶法與經(jīng)典的
GPO-Trinder 酶學反應(yīng)方法,通過比色測定液體樣本中的甘
油含量。經(jīng)過優(yōu)化后,操作步驟更加簡單,檢測線性范圍在
10-1200µmol/L,可靠性和重復性俱佳,適合生物醫(yī)學、食
品實驗室檢測。
原理:在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油,
再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫;在過氧化物酶作用
下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺,其光密度值與甘油濃度成正
比。
適用范圍:測定血液、細胞培養(yǎng)基、體液、酒類飲料中的甘
油濃度。
組成 :(以 250 次為例)
(1) R1 試劑 40 ml
(2) R2 試劑 10 ml
(3) 4 mmol/L 甘油標準品 1 ml
4 oC 保存,6 個月有效
所需設(shè)備:酶標儀、生化分析儀或 721、722 型可見光分光
光度計。工作波長 550nm,如無此波長建議優(yōu)先選用
570nm、次選 530、490nm。
一 樣本處理:
1. 酒類、飲品、清澈液體樣本:可直接進行測定,如超過
線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后再進行測定。
2. 培養(yǎng)液:取不含酚紅、無顏色、無血清的細胞培養(yǎng)基,
如有細胞碎片應(yīng) 4oC,,12,000g 離心 5min,取上清進行測
定。
3. 血液:對于新鮮抗凝血而言,可 4oC,2,000g 離心 5min
得到血漿;而對于非抗凝血來說,可先 4oC 靜置 2h 得
到血清后,2000g 離心 10min,除去血細胞。將得到的血
漿/血清 70oC 加熱 10 分鐘滅活內(nèi)源脂肪酶,12,000g
離心 10min ,去上清進行測定或-20oC 保存。
二 工作溶液配制:按 4:1 比例,取 4 ml 試劑 R1 與 1 ml 試
劑 R2 混合即可,立即使用或 4oC 保存<1 天,變色棄去。
三 標準品稀釋:用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致
的液體,將 4 mM 甘油標準品倍比稀釋為 1000、500、
250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L,通常
取其中 4~6 管即可,注意設(shè)置 0 濃度對照反應(yīng)管。
四 甘油濃度測定:
1. 參見下表進行加樣。為使反應(yīng)時間盡量一致,減小實驗
誤差,可先加入標準品、待測樣品,然后再加入工作溶
液。(注意:當甘油濃度較低時,可將待測樣品與工作
溶液按照 100µl:100µl 體積進行混合,然后再進行測定,
但是如果樣品體積超過 100µl 時將會稀釋工作液中酶
的濃度,致使反應(yīng)靈敏度下降。如果待測樣品濃度超過
線性范圍的時候,可進行適當稀釋,然后根據(jù)稀釋倍數(shù)
來計算樣品中甘油濃度。)
2. 37oC 或 25oC 反應(yīng) 15 分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在 60 分鐘
內(nèi)穩(wěn)定。
3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零,然后測定各管 OD
值。
4. 繪制標準曲線并計算甘油濃度。
附 Excel 作圖步驟:各標準管 OD 值為 y 軸,標準品濃
度為 x 軸。(1)鼠標左鍵圈住數(shù)據(jù),點擊做圖向?qū)?,選
擇-散點圖-,點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一
點,點擊-添加趨勢線-,點擊-選項-,點擊-顯示公式-
和-R 2值-。
表一:
酶標微板測定的加樣比例(檢測范圍 10-1200µmol/L)
(可對樣品和工作液比例進行微量調(diào)整)
說明:
1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫
蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測試。
2. 正常血清甘油濃度為20-130µmol/L,細胞培養(yǎng)時須用不含酚
紅的無色無血清培養(yǎng)基,如果培養(yǎng)基中含有酚紅,可以選擇
含有酚紅的無細胞培養(yǎng)基作為對照進行測定。
參考文獻:
1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.
2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145
液體樣本甘油酶法測定試劑盒