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硫氧還蛋白過氧化物酶測定試劑盒

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硫氧還蛋白過氧化物酶測定試劑盒,TPX屬于過氧化物酶家族,在體內主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現(xiàn)抗氧化作用,功能與GPX類似,也是谷-胱甘肽氧化還原循環(huán)關鍵酶之一。

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硫氧還蛋白過氧化物酶測定試劑盒

Thioredoxin peroxidase,分光光度法 100T/48 樣)

一、測定意義

TPX屬于過氧化物酶家族,在體內主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現(xiàn)抗氧化作用,功能與GPX類似,也是谷-胱甘肽氧化還原循環(huán)關鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內,如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細菌和古細菌,在進化上高度保守。TPX與細胞增殖、分化、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生調控密切相關。TPX的主要功能包括細胞脫毒、抗氧化和調節(jié)由過氧化氫介導的信號轉導和免疫反應。

二、測定原理

TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇(DTT),H2O2的吸收波長為240nm,通過測定240nm吸光度的下降速率,通過對照減去過氧化氫酶(CAT)催化分解的H2O2,即可計算出TPX活性。

因此,本試劑盒可以同時測定樣品TPXCAT活性。

三、自備儀器用品

低溫離心機、紫外分光光度計、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調節(jié)移液槍、蒸餾水

四、試劑組成和配制

試劑一 液體×1 瓶,室溫保存;

試劑二 液體×1 瓶,-20°C保存;

試劑三 液體×1 支,4°C保存。

五、粗酶液提取

1.組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)15~10 的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。10000g4離心10min,取上清置冰上待測。

2.細菌、真菌: 按照細胞數(shù)量(10 4個):試劑一體積(mL)500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎(功率300W,超聲3s,間隔7秒,總時間3min);在4°C1000g離心10min,取上清,置冰上待測。

六、TPX測定步驟

1. 分光光度計預熱30min 以上,調節(jié)波長到240nm,用蒸餾水調零;

2. 試劑一和試劑二置于37(哺乳動物)或25(其它物種)預熱30min 以上;

3. CAT活性測定管:取1mL石英比色皿,加入20μL上清液,900μL試劑一,80μL試劑三,迅速混勻后與240nm測定10s130s吸光度,分別為A1A2,計算ΔACAT=A1-A2

4. 總活性測定管:取1mL石英比色皿,加入20μL上清液,900μL試劑二,80μL試劑三,迅速混勻后與240nm測定10s130s吸光度,分別為A3A4ΔA=A3-A4

注:對大量樣品,每個樣品都需要單獨測定其CAT活性。

七、TPX活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義:在3725,每毫克蛋白每分鐘催化1μmol H2O21U。

CAT活性(U/mg prot) = ACAT÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V)÷T =0.573×ACAT÷ Cpr

總活性(U/mg prot=A÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V)÷T =0.573×A÷ Cpr

TPX活性(U/mg prot=總活性-CAT活性

(2) 按樣本質量計算

單位的定義:在3725,每g組織每分鐘催化1μmol H2O21U。

CAT活性(U/g ACAT÷(ε×d)×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T =0.573×ACAT÷W

總活性(U/g=A÷(ε×d)×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T =0.573×A÷W

TPX活性(U/g=總活性-CAT活性

(3) 按細胞數(shù)量計算

單位的定義:在3725,每10 4個細胞每分鐘催化1μmol H2O21U。

CAT活性(U/10 4 cells = ACAT÷(ε×d)×V反總÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T =0.573×ACAT÷細胞數(shù)量

總活性(U/10 4 cells=A÷(ε×d)×V反總÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T =0.573×A÷細胞數(shù)量

TPX活性(U/10 4 cells=總活性-CAT活性

εH2O2240nm 處摩爾吸光系數(shù)為4.36×10 4L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;

d:比色皿光徑(cm),1cm

V反總:反應體系總體(L),1000μL=1×10 -3L

Cpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA 蛋白質含量測定試劑盒;

V:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02mL

V樣總:加入提取液體積,1mL;

T:催化反應時間(min),2min

W:樣本質量,(g);

細胞數(shù)量,(10 4)。

 硫氧還蛋白過氧化物酶測定試劑盒

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