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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)代測(cè)

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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)代測(cè),免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP),是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A/G“特異性地結(jié)合到抗體(免疫球蛋白)的FC片段的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。

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所有產(chǎn)品僅供科研使用,不能用于食用和醫(yī)療等

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)代測(cè)

 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP),是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A/G"特異性地結(jié)合到抗體(免疫球蛋白)的FC片段的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。

服務(wù)說(shuō)明

  1. 細(xì)胞培養(yǎng)(貼壁細(xì)胞:100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中單層細(xì)胞長(zhǎng)滿80%-90%或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞達(dá)到2-5×107個(gè),懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,細(xì)胞達(dá)到2-5×107個(gè));
  2. 加1ml(800uL)冰冷的 IP細(xì)胞裂解液到細(xì)胞培養(yǎng)皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑(1:50)和PMSF(1:100),如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑(1:100),注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】4℃裂解細(xì)胞10min,再用移液器反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞,然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中;
  3. 用1ml(400uL)冰冷的IP細(xì)胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑(1:50)和PMSF(1:100),如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑(1:100),注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿,將殘留裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中;
  4. 10000g、4℃離心細(xì)胞裂解懸浮液10min,將上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中,冰上操作,然后測(cè)定蛋白濃度(取少量細(xì)胞裂解液變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白);

選做:A.向細(xì)胞裂解液上清中加入1.0μg IgG(與IP及COIP實(shí)驗(yàn)一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG)和20μL A/G-珠子(使用前充分混勻),4℃搖轉(zhuǎn)孵育30min;

  1.       ℃離心細(xì)胞裂解液5min,將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的15ml離心管中,冰上操作,然后測(cè)定蛋白濃度(取少量細(xì)胞裂解液上清變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白);
  2.  

5.  取以上細(xì)胞裂解液上清1ml(或者100-500μg細(xì)胞總蛋白)到1.5ml離心管中,加入1-10μL(0.2-2μg)一抗(同時(shí)加相同量的與一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG作為陰性對(duì)照),然后4℃孵育1h;(一般加入1.0μg一抗,具體一抗加入量根據(jù)IP級(jí)抗體使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋)

6.  再加入20μL A/G-珠子(使用前充分混勻),用手指輕輕彈勻,4℃搖轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜;

7.  4℃ 1000g離心5min,小心吸去上清,注意不要吸到底部的珠子,收集免疫沉淀復(fù)合物;

8.  將免疫沉淀復(fù)合物用1ml冰冷的IP裂解液(不用加各種抑制劑)洗滌4次,每次4℃ 1000g離心5min,每次洗滌小心棄去上清;

9.  zui后一次洗滌之后,小心棄去上清后,加入40μL 1×SDS含巰基乙醇的上樣緩沖液,沸水煮10min(除去Agrose-proteinA/G同時(shí)將一抗變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD)后4℃1000g離心5min取上清;

10. 取20μL上清樣品用于WB檢測(cè)(選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn),這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無(wú)種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn),可以大大減弱抗體分子的重鏈和輕鏈分子的WB信號(hào)。)

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)代測(cè)

實(shí)驗(yàn)材料:1.Agrose-proteinA/G:Santa  貨號(hào):SC-2003

2.IP細(xì)胞裂解液配方:

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl(150mM)              8.766g

0.25%脫氧膽酸               2.5g

1% NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加純水定容至1L。

IP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

注意事項(xiàng)

 1.細(xì)胞樣品量要達(dá)到2-5×107個(gè),裂解細(xì)胞要使用溫和型裂解液-IP裂解液,裂解完后不要加含巰基乙醇的上樣緩沖液變性,經(jīng)免疫沉淀后再變性;

 2.IP及COIP實(shí)驗(yàn)抗體使用量依據(jù)目的蛋白濃度確定,用量應(yīng)該使目的蛋白*沉淀,一般按照IP級(jí)抗體使用說(shuō)明進(jìn)行稀釋(抗體使用單抗來(lái)避免污染,多抗也可以做,效果沒(méi)有單抗好),一般加入1μg;

 3.對(duì)于IP及 COIP實(shí)驗(yàn)的目的蛋白(實(shí)驗(yàn)zui后進(jìn)行WB檢測(cè)的蛋白)分子量在25KD和55KD左右的,可能會(huì)被干擾(解決方案就是選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)或者使用交聯(lián)劑將抗體與A/G-珠子交聯(lián),然后添加不含巰基乙醇的上樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-A/G-珠子復(fù)合物后,去除抗體-A/G-珠子復(fù)合物,上清中只含有目的蛋白)。

 

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