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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)代測(cè)

 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP），是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A/G"特異性地結(jié)合到抗體（免疫球蛋白）的FC片段的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。

服務(wù)說(shuō)明

1. 細(xì)胞培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞：100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中單層細(xì)胞長(zhǎng)滿80％-90％或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞達(dá)到2-5×10⁷個(gè)，懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到2-5×10⁷個(gè)）；
2. 加1ml（800uL）冰冷的 IP細(xì)胞裂解液到細(xì)胞培養(yǎng)皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】4℃裂解細(xì)胞10min，再用移液器反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中；
3. 用1ml(400uL)冰冷的IP細(xì)胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿，將殘留裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中；
4. 10000g、4℃離心細(xì)胞裂解懸浮液10min，將上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，冰上操作，然后測(cè)定蛋白濃度（取少量細(xì)胞裂解液變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白）；

選做：A.向細(xì)胞裂解液上清中加入1.0μg IgG（與IP及COIP實(shí)驗(yàn)一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG）和20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），4℃搖轉(zhuǎn)孵育30min；

1.       ℃離心細(xì)胞裂解液5min，將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的15ml離心管中，冰上操作，然后測(cè)定蛋白濃度（取少量細(xì)胞裂解液上清變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白）；
2.  

5.  取以上細(xì)胞裂解液上清1ml（或者100-500μg細(xì)胞總蛋白）到1.5ml離心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）一抗（同時(shí)加相同量的與一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG作為陰性對(duì)照），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg一抗，具體一抗加入量根據(jù)IP級(jí)抗體使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋）

6.  再加入20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），用手指輕輕彈勻，4℃搖轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜；

7.  4℃ 1000g離心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀復(fù)合物；

8.  將免疫沉淀復(fù)合物用1ml冰冷的IP裂解液（不用加各種抑制劑）洗滌4次，每次4℃ 1000g離心5min，每次洗滌小心棄去上清；

9.  zui后一次洗滌之后，小心棄去上清后，加入40μL 1×SDS含巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水煮10min（除去Agrose-proteinA/G同時(shí)將一抗變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD）后4℃1000g離心5min取上清；

10. 取20μL上清樣品用于WB檢測(cè)（選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無(wú)種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，可以大大減弱抗體分子的重鏈和輕鏈分子的WB信號(hào)。）

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)代測(cè)

實(shí)驗(yàn)材料：1.Agrose-proteinA/G：Santa  貨號(hào)：SC-2003

2.IP細(xì)胞裂解液配方：

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl（150mM）              8.766g

0.25％脫氧膽酸               2.5g

1％ NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加純水定容至1L。

IP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

注意事項(xiàng)

 1.細(xì)胞樣品量要達(dá)到2-5×10⁷個(gè)，裂解細(xì)胞要使用溫和型裂解液-IP裂解液，裂解完后不要加含巰基乙醇的上樣緩沖液變性，經(jīng)免疫沉淀后再變性；

 2.IP及COIP實(shí)驗(yàn)抗體使用量依據(jù)目的蛋白濃度確定，用量應(yīng)該使目的蛋白*沉淀，一般按照IP級(jí)抗體使用說(shuō)明進(jìn)行稀釋（抗體使用單抗來(lái)避免污染，多抗也可以做，效果沒(méi)有單抗好），一般加入1μg；

 3.對(duì)于IP及 COIP實(shí)驗(yàn)的目的蛋白（實(shí)驗(yàn)zui后進(jìn)行WB檢測(cè)的蛋白）分子量在25KD和55KD左右的，可能會(huì)被干擾（解決方案就是選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)或者使用交聯(lián)劑將抗體與A/G-珠子交聯(lián)，然后添加不含巰基乙醇的上樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-A/G-珠子復(fù)合物后，去除抗體-A/G-珠子復(fù)合物，上清中只含有目的蛋白）。