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real-time PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)

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real-time PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)

Real-Time PCR 技術(shù),又稱(chēng)實(shí)時(shí)定量熒光PCR,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,Z后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行總量分析或通過(guò)Ct值對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量。

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real-time PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)

Real-Time PCR 技術(shù),又稱(chēng)實(shí)時(shí)定量熒光PCR,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,zui后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行總量分析或通過(guò)Ct值對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量。

服務(wù)說(shuō)明

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟

1、總RNA抽提(槍頭和離心管均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌,無(wú)RNA酶)

1)取勻漿器,加入1ml的Trizol Reagent,置冰上預(yù)冷。

2)取100mg組織,加入到勻漿器中。

3)充分研磨直至無(wú)可見(jiàn)組織塊。

4)13000g離心10min取上清。

5)加入250 μl,顛倒離心管15s,充分混勻,靜置3min。

6)4℃下13000g離心8min。

7)將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,加入0.8倍體積的異丙醇,顛倒混勻。

8)-20℃放置15min。

9)4℃下13000g離心10min,管底的白色沉淀即為RNA。

10)吸除液體,加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。

11)4℃下13000g離心5min。

12)將液體吸除干凈,將離心管置于超凈臺(tái)上吹3min。

13)加入20μl無(wú)RNA酶的水溶解RNA。

14)55℃孵育5min。

2、反轉(zhuǎn)錄(槍頭和PCR均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌,無(wú)RNA酶)

1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。

2)加入1μl oligo(dT)15。

3)用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。

4)于PCR儀上70℃保溫5min,迅速置冰上冷卻。

5)依次加入4μl  5×buffer,2μl  10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶,用槍抽吸混勻。

6)于PCR儀上42℃保溫60min,結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

3、定量PCR

1)取0.2ml PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。

2× qPCR Mix  12.5μl

7.5μM基因引物 2.0μl

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

2)取0.2ml PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。

2×qPCR Mix  12.5μl

7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

3)PCR擴(kuò)增

預(yù)變性    95℃,10min

循環(huán)(40次)      95℃,15s→60℃,60s

溶解曲線(xiàn)   75℃→95℃,每20s升溫1℃

4、結(jié)果處理

ΔΔCT法:

A=CT(目的基因,待測(cè)樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,待測(cè)樣本)

B=CT(目的基因,對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,對(duì)照樣本)

K=A-B

表達(dá)倍數(shù)=2-K

real-time PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)

 

注意事項(xiàng)

1、長(zhǎng)度:15—30bp。 

2、G十c含量:應(yīng)在40%一60%之間。

3、堿基分布的隨機(jī)性

4、引物自身:不要含有自身互補(bǔ)序列,否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。

5、引物之間:兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基,不然會(huì)形成引物二聚體,尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。

6、上下游引物的互補(bǔ)性:一個(gè)引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。

7、3’末端:如果可能的話(huà),每個(gè)引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。

8、設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí),上下游引物要跨內(nèi)含子,以消除基因組DNA的干擾。

9、引物設(shè)計(jì)好后再NCBI上進(jìn)行序列比對(duì),檢查是否可能有錯(cuò)配產(chǎn)物擴(kuò)增。

10、引物設(shè)計(jì)要注意種屬。

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