果糖磷酸激酶活性測(cè)定試劑盒 生化試劑
- 型 號(hào):
- 參考價(jià):0~0
果糖磷酸激酶活性測(cè)定試劑盒,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)換為果糖-1,6-二磷酸和ADP,是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。
果糖磷酸激酶活性測(cè)定試劑盒
(6-phosphofructokinase,分光光度法 50T/48 樣)
一、測(cè)定意義
果糖磷酸激酶(PFK)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物
和培養(yǎng)細(xì)胞中,負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)換為果糖-1,6-
二磷酸和ADP,是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。
二、測(cè)定原理
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和
ADP,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化
生成NAD+,在340 nm下測(cè)定NADH下降速率,即可反應(yīng)PFK
活性。
三、自備儀器用品
離心機(jī)、紫外分光光度、水浴鍋、1mL石英比色皿、移
液槍、研缽、冰和蒸餾水
四、試劑組成和配制
提取液:60mL×1 瓶, 4℃保存
試劑一:40mL×1 瓶,4℃保存
試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存,臨用前加2.8mL蒸餾水充
分溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復(fù)凍融
試劑三:粉劑×1 支,4℃保存,臨用前加0.26mL蒸餾水充
分溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復(fù)凍融
試劑四:液體×1 支,4℃保存,臨用前加0.26mL蒸餾水充
分溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復(fù)凍融
五、樣品前處理
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心
后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(10 4個(gè)):提取液體積
(mL)500-1000:1的比例(建議1000萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加
入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率
20%或200W,超聲3s,間隔10 秒,重復(fù)30 次);在4°C
下8000g離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)1:5~10 的
比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰
浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測(cè)。
3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)
六、測(cè)定步驟
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm,用蒸餾
水調(diào)零。
2. 工作液(可測(cè)25個(gè)樣)的配置:取19mL試劑一和1.26mL
試劑2充分混勻;用不完的試劑4℃保存一周。
3. 將工作也置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱
10min。
注意:不同勻漿組織中PFK活性不一樣,做正式試驗(yàn)
之前請(qǐng)做1-2只預(yù)實(shí)驗(yàn),若△A>0.5,則說(shuō)明活力太高,
必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液(計(jì)算公式
中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),或縮短反應(yīng)時(shí)間至2min或
5min,使得△A<0.5,以提高檢測(cè)靈敏度。
七、PFK活性計(jì)算
1、血清(漿)活力的計(jì)算:
單位的定義:每mL 血清(漿)在每分鐘催化1nmol果糖
-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖-1,6-二
磷酸和1nmolADP定義為一個(gè)酶活力單位。
PFK(U/mL) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷V ÷T
=450×△A
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計(jì)算
(1).按組織蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-
磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖-1,6-
二磷酸和1nmolADP定義為一個(gè)酶活力
單位。
PFK(U/mg) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(Cpr×V樣)÷T
=450×△A÷Cpr
(2).按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和
1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖-1,6-二磷酸
和1nmolADP定義為一個(gè)酶活力單位。
PFK(U/mg) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(W×V 樣÷V樣總)÷T
=450×△A÷W
(3). 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol果
糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖
-1,6-二磷酸和1nmolADP定義為一個(gè)酶
活力單位。
PFK(U/mg) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(1000×V樣÷V樣總)÷T
=0.45×△A
ε:NADH在340nm 處摩爾吸光系數(shù)為6.22×10 3L/mol/cm;
d :比色皿光徑(cm),1cm;
V反總:反應(yīng)體系總體(L),840μL=8.4×10 -4L;
10 9:1mol=1×10 9nmol;
Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)
V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),30μL=0.03mL;
V樣總:加入提取液體積,1mL
T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10min。
W,樣本質(zhì)量,(g)
1000: 細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),1000萬(wàn)。
果糖磷酸激酶活性測(cè)定試劑盒