過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒
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過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒,分解 H2O2 的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止,剩余的 H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物,在 405nm 處測定其變化量,可計算出 CAT的活力。
過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒
(鉬酸銨法)
一、測定原理:
過氧化氫酶(Catalase)分解 H2O2 的反應(yīng)可通過加入
鉬酸銨而迅速中止,剩余的 H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡
黃色的絡(luò)合物,在 405nm 處測定其變化量,可計算出 CAT
的活力。
二、試劑組成與配制:(100 管/96 樣)
試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存 6 個月。
試劑二:底物液體 10mL×1 瓶,4℃保存 6 個月。
試劑三:顯色粉劑×1 瓶,4℃保存 6 個月。加雙蒸水 100mL
溶解,4℃保存 1 個月。(如果底部有不溶粉末沉
淀,直接取上清使用,不影響測定結(jié)果)
試劑四:液體 10mL×1 瓶,4℃保存 6 個月。天冷時會凝固,
臨用前 37℃加熱至透明方可使用。
(二)、組織樣本的檢測:
1、組織勻漿液的制備:準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g):體
積(mL)=1:9 的比例加入 9 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件
下,制備成 10%的組織勻漿,2500 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘,取上
清,再用生理鹽水稀釋成取樣濃度,待測(取樣濃
度摸索見附錄)。
注:一般情況下樣本沒有高脂(渾濁、不透明)、顏色
等導(dǎo)致顯著差異情況,對照管的樣本可隨機(jī)取樣,做 1~
2 管對照即可。如需做樣本自身對照,則試劑盒所測定
樣本數(shù)量減至 48 樣。
3、組織中 CAT 活力的計算:
(1)、定義:每毫克組織蛋白每秒鐘分解 1µmol 的 H2O2
為一個活力單位。
注:271 為斜率的倒數(shù),常數(shù),直接使用;V 樣:取樣量,
0.05mL;T:反應(yīng)時間,60 秒;Cpr:勻漿液蛋白濃
度,mgprot/mL(prot 指蛋白)。
(三)、全血的檢測:
1、1﹕99 溶血液的制備:取 50µL 全血加雙蒸水至 5mL 充
分混勻后放置 10 分鐘,待測。
注:全血樣本測定時必須每個樣本都要做自身對照管,空白
對照管只需做 1 管。
3、血紅蛋白中 CAT 活力的計算:
(1)、定義:每毫克血紅蛋白每秒鐘分解 1µmol 的 H2O2
為一個活力單位。
四、注意事項:
1、本試劑盒也可用酶標(biāo)儀讀數(shù)(即在反應(yīng)完后取 200μL 反
應(yīng)液加入孔板(注意避免氣泡產(chǎn)生),405nm 處讀數(shù),
計算公式斜率倒數(shù)變?yōu)?/span> 235.65 代入計算);
2、植物樣本在測定時,一般不需要稀釋來摸索濃度(因
為植物中 CAT 活力較低),可直接取樣測定(或加大樣本
量測定),計算時也可不測蛋白濃度,改用質(zhì)量濃度(植
物質(zhì)量(g)/提取液總體積(mL))代替蛋白濃度代入計
算即可;
3、測定時,加入試劑二的同時需要計時,反應(yīng)到 60 秒時
必須加入試劑三以終止反應(yīng);
4、細(xì)胞樣本做法也可參照組織樣本,前處理可參考本公
司“技術(shù)支持"中“技術(shù)文章"。
附錄Ⅰ:取樣濃度摸索
一、樣本來源:正常小鼠肝組織
二、前處理:
10%勻漿液的制備:準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g)
:
體積(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體積的生理鹽水,冰
水浴條件下機(jī)械勻漿,制成 10%的組織勻漿,2500 轉(zhuǎn)/
分,離心 10 分鐘,取上清液待測;10%的勻漿液再用生
理鹽水稀釋成不同的濃度: 5%、2%、1%、0.5%、0.25%、
0.125%
過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒