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elisa試劑盒的操作要點

更新時間:2024-04-17   點擊次數(shù):127次
elisa試劑盒的操作要點
 
 elisa試劑盒操作步驟包括樣本的采集和保存、試劑和樣本的平衡、加樣、溫育、洗滌、顯色、比色、結(jié)果判定和結(jié)果報告。環(huán)節(jié)眾多,任一環(huán)節(jié)操作不當(dāng),皆可影響測定結(jié)果。因此,必須重視各環(huán)節(jié)操作,掌握控制要點,方能保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠
樣本的采集和保存  
作為激素和治療藥物測定的樣本應(yīng)考慮采集時間及體位等因素影響,可-的松和促甲狀腺激素清晨會有一峰值出現(xiàn);生長激素、促黃體激素、促卵泡激素均以陣發(fā)性方式排放;從臥位變?yōu)檎疚粫r,腎素活性將明顯增高;藥物濃度監(jiān)測應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇合適時間采集樣本。
內(nèi)源性干擾因素對檢測結(jié)果的影響,如類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、鼠抗體診療所致抗鼠Ig抗體、溶-菌酶等。可以通過稀釋、加熱、改變固相和酶標(biāo)抗體、使用雞抗體IgY以及理化方法去除干擾因子。
外源性干擾因素對檢測結(jié)果的影響,溶血、脂血、細(xì)菌污染、血液標(biāo)本收縮不充分、存貯過久、反復(fù)融凍等。盡量使用玻璃試管抽血,慎用塑料試管盛血,因聚乙烯易吸附抗原和抗體,影響檢測結(jié)果。
2日內(nèi)測定血液樣本,,置2℃—8℃冰箱保存;2日至7日內(nèi)測定,置2℃—8℃冰箱保存;7日以上測定,置-20℃以下冰箱保存。
試劑和樣本的平衡   
試劑和樣本在測定前應(yīng)先放置室溫(20℃—25℃)平衡20分鐘以上,以保證后續(xù)操作步驟中抗原抗體足夠反應(yīng)溫度。
加樣本及試劑   
應(yīng)正確使用移液器和試劑滴瓶。移液器應(yīng)定期校準(zhǔn)和維護,加樣本時,應(yīng)加在微孔下1/3處,不可擦劃底部、沖起泡、加到微孔上緣或濺出。滴加試劑(包括抗原、酶結(jié)合物及顯色劑)時,應(yīng)搖勻試劑,先棄去瓶口1—2滴,然后垂直、均勻加入微孔。
溫育  
溫育是ELISA操作中的關(guān)鍵步驟。國產(chǎn)試劑通常采用37℃30分鐘和37℃60分鐘兩種方式。為保證溫度均一,抗原抗體反應(yīng)充分,宜采用水浴方式加熱。如用孵箱,可內(nèi)置一方盤,底襯紗布,加入適量水,微孔板放入其中溫育。
洗滌 

ELISA為異相固態(tài)方式檢測,所以分離結(jié)合和游離酶結(jié)合物是一個重要環(huán)節(jié),洗滌即是達到這樣一個目的。洗板質(zhì)量直接影響檢測結(jié)果,所以需重視洗板質(zhì)量?,F(xiàn)在新推出的洗板機大多增設(shè)有兩點吸液、底部沖洗和振蕩等功能,可以充分保證洗板質(zhì)量。手工洗板時,應(yīng)嚴(yán)格按照試劑說明書操作,洗滌不足和洗滌過度都將影響檢測結(jié)果。

顯色   

ELISA顯色常用TMB和H2O2作為顯色劑,顯色時間37℃15—20分鐘,顯色過程可不避光。使用前應(yīng)檢查顯色劑是否變質(zhì),嚴(yán)格控制顯色時間。顯色劑質(zhì)量檢查,在玻片、試管或eppendorf管中滴入顯色劑A和B各一滴,若不變色,則質(zhì)量可靠。繼續(xù)滴入一滴酶結(jié)合物,搖勻后幾分鐘內(nèi)溶液出現(xiàn)藍色,既可檢查顯色劑質(zhì)量,又可檢查酶結(jié)合物質(zhì)量。
比色   
加終止液終止顯色反應(yīng)后,通常要求30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀完成比色測定。采用主波長450nm測定,可有效避免微孔上的劃痕、指印及其它附著物對光的干擾。另外,加終止液后,應(yīng)盡快比色,因為呈色深的微孔易出現(xiàn)沉淀致吸光度下降明顯。
結(jié)果判斷和結(jié)果報告   
判斷結(jié)果時,要正確按照試劑盒要求設(shè)置計算參數(shù),內(nèi)外對照值均應(yīng)在控,才能判定測定結(jié)果有效。對于少見模式和臨界值附近結(jié)果應(yīng)堅持復(fù)核


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