免疫熒光實(shí)驗(yàn)代測(cè)找上海信帆生物
更新時(shí)間:2017-07-12 點(diǎn)擊次數(shù):2007次免疫熒光實(shí)驗(yàn)代測(cè)找上海信帆生物
上海信帆生物代做免疫熒光實(shí)驗(yàn)。老師提供樣本即可,我司可以進(jìn)行蠟塊切片可提供抗體等。免疫熒光檢測(cè)我們分單標(biāo)和雙標(biāo)。
在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測(cè)兩種抗原時(shí),需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?。雙重免疫熒光標(biāo)記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)代測(cè)找上海信帆生物
冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟
1、 冰凍切片固定:冰凍切片從冰箱拿出來(lái)復(fù)溫,晾干水分,冷丙酮固定10min,待丙酮*干后于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。
2、 修復(fù):切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫(huà)圈(防止液體流走),在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS 1:9稀釋)覆蓋組織,37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。
3、 破膜:切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。
4、 加試劑1,2:按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合(試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用),加到圈內(nèi)覆蓋組織,切片平放于濕盒內(nèi),37℃恒溫孵育2小時(shí),濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、 BSA封閉:將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min,在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。
6、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))
7、 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。
8、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核:切片用PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
9、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm,發(fā)射波長(zhǎng)420nm;FITC綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm,發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm;CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560,發(fā)射波長(zhǎng)590nm)
石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟
1、 石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-無(wú)水乙醇Ⅰ10min-無(wú)水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗(冬天脫蠟時(shí)間稍微延長(zhǎng))。
2、 修復(fù):切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫(huà)圈(防止液體流走),在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS 1:9稀釋)覆蓋組織,37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。
3、 破膜:切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。
4、 加試劑1,2:按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合,加到圈內(nèi)覆蓋組織,切片平放于濕盒內(nèi),37℃恒溫箱孵育2小時(shí),濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、 BSA封閉:將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min,在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。
6、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))
7、 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。
8、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核:切片用PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
9、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm,發(fā)射波長(zhǎng)420nm;FITC綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm,發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm;CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560,發(fā)射波長(zhǎng)590nm)
實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng):
1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)使熒光提前衰退。
2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對(duì)照:
(1) 陽(yáng)性對(duì)照:陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物;
(2) 陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物;
(3) 熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物。
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