基質金屬蛋白酶MMP2/MMP9明膠酶譜法試劑盒
更新時間:2017-03-24 點擊次數:1271次基質金屬蛋白酶(MMP2/9)明膠酶譜法試劑盒
適用: 檢測 MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。 組成與儲存 (50 assays):
- 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml ?l, ?20 ?C;
- 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 ?C;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ?C, 使用時用蒸餾水稀釋;
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ?C, 使用時用蒸餾水稀釋;
5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(#P1501), 4 ?C。
檢測步驟:
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠:分離膠濃度為 8%。按照標準程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化,并 90 ?C 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍,混勻后加入過硫酸銨和 TEMED,等待凝膠聚合。
2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染 Marker 即可。陽 性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔 100?l 全血與 100?l 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 等體積混合,取 5-15?l 上樣。
3. 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為 20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
4. 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入 10 ml1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。
5. 孵育:倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或 37?C 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37?C 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低,應延長孵育時間為 10 小時或 過一夜。
6. 顯色:倒掉 Buffer B,加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現透 明條帶。
7. 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑 色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。
基質金屬蛋白酶(MMP2/9)明膠酶譜法試劑盒
說明
1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性。
2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠,作為*記錄保留。
參考文獻:
- Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
- Heussen C, and Dowdle EB.Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,1980, 102, 196–202
常規(guī)考馬斯亮藍 SDS-PAGE 凝膠蛋白質染色是實驗室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高,但所需試劑復雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。
染色步驟:
1. 此染色液即為工作液,使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠,并緩慢搖動 2h;
2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠;
3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動 2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進行脫色,直至獲得清晰的 藍色的條帶和干凈的背景(通常此過程需要 2~4h,也可脫色過一夜至清晰的藍色的條帶和干凈 的背景);
4. 對凝膠進行分析和照相,凝膠可放置在 7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對 凝膠進行處理后保存。
安全性:含有甲醇,無特殊毒性,按一般化學品操作規(guī)程處理。
說明:
1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍 R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,定容至 1000ml,混合 1h 后用 Whatman 1 號濾紙過濾,于室溫可無限期保存;
2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V);
3. 保存液:7%冰醋酸;
4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內,室溫或 4 ?C 保存,可反復使用 2-4 次。
基質金屬蛋白酶(MMP2/9)明膠酶譜法試劑盒
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