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信帆生物告訴大家:關(guān)于Western blot實(shí)驗(yàn)異常分析

更新時(shí)間:2016-05-26   點(diǎn)擊次數(shù):1155次

關(guān)于Western blot實(shí)驗(yàn)異常分析


『無信號(hào)』

原因建議
一抗與二抗不匹配選擇針對(duì)一抗來源種屬制備的二抗;
一抗不識(shí)別目的的種屬的蛋白

1)檢查抗體的說明書,適用范圍內(nèi)是否包含目的種屬
2)使用陽性對(duì)照來檢查抗體質(zhì)量

一抗或二抗不足,沒有足夠的抗體結(jié)合到目的蛋白

1)降低抗體稀釋倍數(shù),增加抗體濃度
2)延長孵育時(shí)間

封閉劑與一抗有交叉反應(yīng)改變封閉劑
抗原不足

1)每個(gè)泳道加入20-30ug總蛋白
2)制備樣品要使用蛋白酶抑制物及使用陽性對(duì)照

在檢測(cè)的組織內(nèi)目的蛋白表達(dá)水平低檢測(cè)樣本不表達(dá)目的蛋白選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對(duì)照,用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性,也可更換細(xì)胞系
蛋白轉(zhuǎn)膜效率低

1)利用麗春紅檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率;檢查轉(zhuǎn)移裝置是否電極弄反
2)轉(zhuǎn)移前膜是否用甲醇侵泡過

膜過渡洗滌減少洗滌時(shí)間和強(qiáng)度
疊氮鈉抑制二抗活性二抗稀釋液內(nèi)不用疊氮鈉

 

 

『沒有特異條帶』

原因建議
細(xì)胞系傳代過多后蛋白表達(dá)譜發(fā)送變化1)使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細(xì)胞系進(jìn)行樣品制備
蛋白本身有很多修飾1)查閱文獻(xiàn),確定目的蛋白是否存在多種修飾
蛋白被消化或者降解1)蛋白樣品確保未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑
所檢測(cè)蛋白存在多種剪接體,導(dǎo)致分子量大小不同1)查閱文獻(xiàn)或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
一抗或二抗?jié)舛雀?/span>1)減低抗體濃度
洗滌不夠1)充分洗滌

 

 

『條帶大小不正確』

原因建議
目的蛋白被降解確保蛋白樣品未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑
存在不同的剪接體查閱文獻(xiàn)或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
重組蛋白檢測(cè)是否存在額外加入的蛋白
特殊蛋白如MDM2等仔細(xì)閱讀抗體說明書

 

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