新品上市:谷氨酰胺酶活性檢測試劑盒
更新時間:2016-05-13 點擊次數(shù):1061次新品上市:谷氨酰胺酶活性檢測試劑盒,歡迎上海信帆生物!
谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測定試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
正式測定前務(wù)必取2-3 個預(yù)期差異的樣本做預(yù)測定
測定意義:
GLS(EC 3.5.1.2)存在于高等動物和某些細(xì)菌以及植物根中,催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和
氨,在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用,尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。
測定原理:
GLS 催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,利用奈氏試劑檢測氨增加的速率,即可計算其酶
活性。
需自備儀器和用品:
臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸
餾水。
試劑組成和配制:
試劑一×1 瓶,60 mL,4 ℃保存;
試劑二×1 瓶,20 mL,4 ℃保存;
試劑三×1 瓶,30 mL,常溫保存;
試劑四×1 瓶,10 mL,常溫保存;
試劑五×1 瓶,6 mL,常溫保存;
試劑六×1瓶,6 mL,常溫避光保存。
粗酶液提?。?br />1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
(104 個):試劑一體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 試
劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30 次);
8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織,
加入1mL 試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、分光光度計預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長至420nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣品測定(在EP 中加入下列試劑):
試劑名稱(uL) 測定管 對照管
樣本 25
蒸餾水 25
試劑一 100 100
試劑二 400 400
混勻,37℃水浴1 小時
試劑三 525 525
混勻,8000 g,25℃離心10 min;取上清液,在EP 管中加入下列試劑
上清液 650 650
試劑四 150 150
試劑五 100 100
試劑六 100 100
混勻,420nm 處讀取吸光值A(chǔ),計算ΔA=A 測定管-A 對照管。對照管只要做一管
計算:
1、血清(漿)GLS 活性
單位定義:每mL 血清(漿)每小時催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個酶活力單位。
GLS(μmol /min/mL)=363.1×(ΔA-0.1301)÷T=363.1×(ΔA -0.1301)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GLS 活性
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每mg 蛋白質(zhì)每小時催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個酶活力單位。
GLS(μmol /min /mg prot)=363.1×(ΔA-0.1301)÷Cpr÷T=363.1×(ΔA -0.1301)÷Cpr。
(2)按樣本鮮重計算:
單位定義:每g 組織每小時催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個酶活力單位。
GLS(μmol /min /g 鮮重)=363.1×(ΔA-0.1301)÷(W÷V 樣總) ÷T=363.1×(ΔA -0.1301)÷W。
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位定義:每1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個酶活力單位。
GLS(μmol /min /104 cell)=363.1×(ΔA-0.1301)÷(500÷V 樣總)÷T =0.7262×(ΔA -0.1301)
V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:
樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。