信帆生物：PCR技術(shù)服務(wù)升級！歡迎聯(lián)系！
更新時間：2016-03-08 點擊次數(shù)：1041次信帆生物：PCR技術(shù)服務(wù)升級！歡迎！
1.技術(shù)優(yōu)勢：
*靈敏度高，可以檢測低拷貝的目的基因
*高精度，PCR擴增階段包括3個階段：指數(shù)增，線性增和平臺期，96個重復指數(shù)增表現(xiàn)出高精度，而平臺期則變化差異
*定量能力強，簡單的流程就能得到高質(zhì)量的定量數(shù)據(jù)
*動力學范圍寬，可以定量9個數(shù)量級的差異，速度快，節(jié)省時間和勞力，不需要電泳檢測
*安全，使用熒光染料發(fā)光，不用EB或放射性物質(zhì)，降低對實驗人員健康的威脅
*重復性好
2.服務(wù)流程
PCR引物、探針設(shè)計合成調(diào)試→標準品制作→樣本核酸抽提反轉(zhuǎn)錄→PCR擴增檢測→數(shù)據(jù)初步分析
3.檢測方法
(1) SYBR Green Ⅰ
游離狀態(tài)下的SYBR Green分子發(fā)出微弱的熒光信號，當與dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合時，則發(fā)出綠色熒光，可在520nm波長下檢測熒光信號，熒光信號的強度與dsDNA數(shù)量呈正相關(guān)。
SYBR Green Ⅰ染料法的特點：
高靈敏度，低背景信號，操作簡單，不影響酶促反應(yīng)，價格便宜。
(2)探針法：TaqMan熒光探針，MGB探針
TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5`末端，一般用FAM、VIC、HEX、Cy3、Cy5等熒光基團，而淬滅劑則在3`末端，一般為TAMRA、BHQ1、BHQ2等，其中TAMRA發(fā)出黃色熒光，BHQ1和BHQ2不發(fā)出熒光。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
TaqMan-MGB探針與普通TaqMan熒光探針相比具有更短的序列和更高的序列特異性，常被用于SNP分型的研究中，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
探針法的特點：
與染料法相比具有更低的背景信號，更高的靈敏度，可以檢測低于10個分子的模板，更高的特異性，結(jié)果也更準確。同時也具有染料法的操作簡單，不影響酶促反應(yīng)等優(yōu)點。
◆核酸提取和反轉(zhuǎn)錄
根據(jù)客戶要求提取動物、植物、細胞和細菌等樣品DNA或RNA
對所提RNA進行反轉(zhuǎn)錄以用于熒光定量PCR反應(yīng)
◆合成
設(shè)計合成各種引物并可根據(jù)客戶要求負責引物的調(diào)試
針對不同引物構(gòu)建標準品用于定量或相對定量實驗
設(shè)計合成各種標記探針并可根據(jù)客戶要求負責探針的調(diào)試
◆檢測
mRNA表達檢測
MicroRNA表達和靶基因表達檢測
SNP檢測
基因copy數(shù)檢測
病原微生物樣品檢測
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