信帆生物代做：mRNA實驗，PCR實驗代測
更新時間：2016-01-11 點擊次數(shù)：1000次信帆生物代做mRNA實驗，咨詢！mRNA實驗PCR代測服務(wù)操作流程！
1. 設(shè)計并合成Realtime PCR引物
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG（SYBR
Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3. RNA抽提
a. 若實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
b. 若實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，*吸去培養(yǎng)液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
4. RNA質(zhì)量檢測
a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度。
b. 使用甲醛電泳試劑（ambion）進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5. cDNA合成
按照逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen或Promega）5. 使用說明將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(可選)
進行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增， 其產(chǎn)物進行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 實時定量PCR
標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTimePCR反應(yīng)液中（其中TaqBead熱啟動聚合酶來自Promega公司），進行RealTime PCR擴增和檢測
8. 數(shù)據(jù)分析
檢測結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。9. 提供實驗報告：包括詳細的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果及相關(guān)圖表。
