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分離提取多酚氧化酶(PPO)

更新時間:2019-05-05   點擊次數:1660次

   多酚氧化酶是植物組織內廣泛存在的一種含銅氧化酶,植物受到機械損傷和病菌侵染后,PPO催化酚與O2氧化形成醌,是組織形成褐變,以便損傷恢復,防止或減少感染,提高抗病能力。醌類物質對微生物有毒害作用,所以傷口醌類物質出現是植物防止傷口感染的愈傷反應,因而受傷組織一般這種酶的活性就會提高。多酚氧化酶也可與細胞內其他底物氧化相偶聯,起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內源的酚類物質生成鄰醌,鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質、氨基酸等作用生成高分子絡合物而導致褐色素的生成,色素分子量愈高,顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標之一。
本實驗將采用馬鈴薯為主要材料,通過組織細胞破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。
   通過本項實驗,學習和了解蛋白質的提取、分離的基本原理和方法,掌握相關儀器設備的操作使用,以及蛋白質的提取、分離的系統(tǒng)技術。
材料與試劑
(1)馬鈴薯(大約每小組100-200g)
(2)試劑:
0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內含0.02M巰基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制時配×10倍的濃縮液1000ml;固體硫酸銨;0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內含0.02M巰基乙醇,0.001MEDTA,0.005MgCL2)配置時配
(3)實驗器械與儀器設備:
試管與試管架;燒杯、玻璃攪棒;移液管、滴管等;試劑瓶;透析袋;
過濾紗布;植物組織勻漿器;pH計和pH試紙;GL-20C高速冷凍離心機;
DL-7A大容量低速冷凍離心機
操作步驟
1:粗酶提?。?br />水果肉組織按1:1(W/V)比例與003M磷酸緩沖液PH6.0(內含0.02M巰基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%聚乙烯吡咯烷酮)混合,勻漿4層后紗布過濾,濾液以6000rpm離心10min,棄除沉淀獲得酶提取液。
2:鹽析分級沉淀:
在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達到40%飽和度(邊加邊攪拌達到充分溶解),然后6000rpm離心20min棄除沉淀;離心上清液在加入固體硫酸銨達到70%飽和度(邊加邊攪拌達到充分溶解),再以6000rpm離心20min,棄除上清夜,收集粗酶沉淀。
實驗結果
獲得PPO粗酶液。

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