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信帆生物又雙叒發(fā)福利:細(xì)胞爬片的制作方法

更新時(shí)間:2019-01-10   點(diǎn)擊次數(shù):1166次

信帆生物又雙叒發(fā)福利:細(xì)胞爬片的制作方法

【細(xì)胞爬片】

1.胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于*培養(yǎng)基中。

 

2.加細(xì)胞時(shí),根據(jù)玻片的大小,先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基,目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起,造成雙層細(xì)胞貼片。整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。

 

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

 

4.待細(xì)胞貼壁后,可去上清加含藥培養(yǎng)基。

 

5.按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力,我一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,48h,72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)的話,將所需數(shù)量的爬片取出時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

【爬片的準(zhǔn)備】

1.爬片可用一般的蓋玻片,也可用爬片;

 

2.應(yīng)用蓋玻片,可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小,以備置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪時(shí)可用前護(hù)士輸液用于打開(kāi)玻璃安瓶的小沙輪,或者是口腔科的那種小沙輪,輕輕劃一下后,稍用力一掰就分開(kāi)了。

 

如果接種大皿的話,我一般不將蓋玻片切開(kāi),直接清潔后放入培養(yǎng)皿中,到染色時(shí)再將之切開(kāi),這樣既保證了細(xì)胞均一性,又可同時(shí)做幾個(gè)指標(biāo)的染色。

 

3.將剪裁好的爬片,置于濃硫酸中浸泡并過(guò)夜,第二天先用自來(lái)水沖洗20遍,再置于無(wú)水酒清中浸泡6小時(shí),再用三蒸水沖洗3遍(個(gè)人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了,如果不干凈的話,細(xì)胞帖壁不好),放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。

 

4.高壓后取出放入烤箱中烤干,備用??靖珊罂煞湃氤瑑襞_(tái)中。

 

5.關(guān)于多聚賴(lài)氨酸,很多人都將玻片用此處理,以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時(shí)從來(lái)沒(méi)用過(guò)多聚賴(lài)氨酸,細(xì)胞貼壁仍然很好,且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測(cè)、免疫熒光等也從未脫過(guò)片。

 

 

【細(xì)胞爬片的固定】

 

細(xì)胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。當(dāng)然,根據(jù)研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡的TUNEL染色時(shí)就避免洗,因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞在洗的過(guò)程中有可能會(huì)脫落。

 

另外在保存細(xì)胞爬片的時(shí)候,我一般用培養(yǎng)皿或板,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實(shí)驗(yàn)時(shí)取片。然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標(biāo)記,為避免混淆,可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個(gè)月的片子做免疫組化是沒(méi)有問(wèn)題的。

以下為常用的固定液

 

1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(放心,丙酮在此溫度不會(huì)為固體的)細(xì)胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性,注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán),防止其揮發(fā))固定10分鐘。取出后,室溫吹干,然后放入-20℃保存。

 

2. 多聚甲醛(常用4%):可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 

主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原,例如各類(lèi)淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等

室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存

 

3. 95%乙醇,可用于免疫組化。

優(yōu)點(diǎn):穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。

缺點(diǎn):但醇類(lèi)對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差,使蛋白變性的作用輕,固定后可再溶解;染色過(guò)程中,溫育時(shí)間長(zhǎng),抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度

室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存

4. 甲醛(福爾馬林)應(yīng)用廣 

優(yōu)點(diǎn):形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好,且穿透性強(qiáng),

缺點(diǎn): 甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色; 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或*掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。

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