如何正確使用明膠酶譜分析試劑盒
更新時(shí)間：2018-10-16 點(diǎn)擊次數(shù)：2108次如何正確使用明膠酶譜分析試劑盒
如果您對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/MMP9明膠酶譜檢測(cè)分析試劑盒感興趣，歡迎上海信帆生物科技有限公司了解！
明膠酶譜分析試劑盒使用注意事項(xiàng)：
1.制備聚丙烯酰胺時(shí)應(yīng)注意排除氣泡。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)有絮狀物，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因?yàn)闀?huì)改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
明膠酶譜分析試劑盒檢測(cè)步驟：
1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。
2 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。
3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。
6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn)后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。
7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。
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使用上海信帆生物明膠酶譜法試劑盒發(fā)表的文章：
《綠茶多酚EGCG增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及其相關(guān)機(jī)制研究》
*部分綠茶多酚EGCG增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目的:急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一系列嚴(yán)重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不穩(wěn)定型心絞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究資料已證實(shí),急性冠脈綜合征發(fā)病的zui主要病理生理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈中不穩(wěn)定型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂,引起冠狀動(dòng)脈內(nèi)急性血栓形成,繼而引起心肌嚴(yán)重的缺血、缺氧。近年來(lái),多項(xiàng)流行病學(xué)研究報(bào)道稱,飲用綠茶可以明顯降低冠心病的發(fā)病率。綠茶的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用主要原因是綠茶中含有大量的多酚類化合物,其中含量zui多的為兒茶素。綠茶中兒茶素主要成分包括表兒茶素(EC),表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG),表沒(méi)食子兒茶素(EGC)和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。在這些成分中,以EGCG含量zui豐富,活性zui強(qiáng),已被證明具有多種藥理學(xué)作用和生物學(xué)特性。我們進(jìn)行本研究主要目的就是為了證實(shí)綠茶多酚EGCG是否能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性并探討其可能的相關(guān)機(jī)制。
方法:30只雄性ApoE缺陷小鼠(6周齡,體重18-20g)被隨機(jī)分為對(duì)照組(n=15)以及EGCG組(n=15)這些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%膽固醇的高脂飲食喂養(yǎng)。EGCG組以及對(duì)照組分別給予EGCG(10mg/kg)或者同等劑量的0.9%生理鹽水進(jìn)行腹腔注射共16周。隨后麻醉處死小鼠,取小鼠頭臂干動(dòng)脈并予固定石蠟包埋。小鼠頭臂干橫切面進(jìn)行HE染色以及Masson染色分別評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形態(tài)以及膠原含量。此外,使用免疫組織化學(xué)染色的方法分析小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞成分的比例。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)用來(lái)檢測(cè)斑塊中蛋白表達(dá)水平,明膠酶譜法用來(lái)檢測(cè)斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物
如何正確使用明膠酶譜分析試劑盒
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