電誘導細胞融合試劑盒的操作步驟
更新時間:2018-07-18 點擊次數:1754次電誘導細胞融合試劑盒的操作步驟
上海信帆生物供應電誘導細胞融合試劑盒,產品現(xiàn)貨供應,質量穩(wěn)定,庫存充足!
細胞融合(cell fusion)是兩個或兩個以上細胞融合并形成一個細胞過程。在自然情況下,
體內、體外發(fā)生的細胞融合的現(xiàn)象稱為自然融合;體外培養(yǎng)的細胞可用人工方法誘導相同或
者不同細胞間發(fā)生融合,稱為人工誘導融合。體外培養(yǎng)的單層貼壁細胞或懸浮細胞均可以做
融合,但成功概率的是單層貼壁細胞。
電誘導細胞融合試劑盒(Electrofusionof cell)是 20 世紀 80 年代發(fā)展起來的一項生物工程技術,其作用原理是先使細胞在在電場
中極化成偶極子,并延電力線成串排列,用高強度、短時程的電脈沖擊穿細胞膜,促使細胞
發(fā)生融合。該細胞融合方法具有無毒、融合頻率高、易控制等優(yōu)點。該試劑盒有效成分經嚴
格無菌處理,僅用于科研領域,不用于診斷或治療。
電誘導細胞融合試劑盒的操作步驟
操作步驟(僅供參考):
1、 準備細胞:
⑴SP2/0 骨髓瘤細胞:融合前,提前 1 天將 SP2/0 骨髓瘤細胞傳代,培養(yǎng)至其處于對數生
。將該細胞收集于無菌離心管中,1000g 離心 8~10min,棄上清液。加入 10ml 無血
清 RPMI 1640 培養(yǎng)基,將細胞沉淀懸浮起來備用。
⑵淋巴細胞:融合前,取經 3 次用目的抗原免疫的 BALB/C 小鼠脾臟,每次免疫間隔 2~3
周,后一次免疫后 3~4 天處死小鼠,取出脾臟,加入 10ml 無血清 RPMI 1640 培養(yǎng)基,
將細胞沉淀懸浮起來備用。
⑶飼養(yǎng)細胞:融合前,收集健康的 BALB/C 小鼠腹腔中的腹水,將腹水(巨噬細胞懸液)
1000g 離 心 8~10min , 棄 上 清 液 。 加 入 25ml HAT 選 擇 培 養(yǎng) 液 ( 按 HAT Media
Supplement:含胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液=1:49 配制),混勻,接種到 96 孔或
24 孔培養(yǎng)板。經培養(yǎng)形成的飼養(yǎng)層細胞,可以輔助新的融合細胞的生長。
2、 細胞融合:
⑴將骨髓瘤細胞和淋巴細胞按 5:1 比例混合,細胞密度為 1.5×107 個/ml,細胞懸液以 1000g
離心 8~10min,棄上清液。
⑵將細胞沉淀加入 5ml PM 脈沖緩沖液,1000g 離心 8~10min,棄上清液。重復 1 次該
步驟。
⑶用少量 PM 脈沖緩沖液重懸細胞沉淀,一般細胞濃度應達到 2×106 個/ml,注入細胞電融
合儀的電極小池或融合槽。注意:應根據不同體積的電極小池或融合槽加入細胞懸液,大多
數細胞電融合儀的融合容積在 20~4000μl 之間。按如下條件電泳:交流電場頻率 1MHz,
振幅 250V/cm,時間 30s。在顯微鏡下觀察,看到 80%的細胞已經形成珠串時,立即加穿
孔電脈沖,其條件為:脈沖幅度 5kV/cm,時間常數 20ms,脈沖個數 5,間隔 1s。
⑷1000g 離心 8~10min,棄上清液。向細胞沉淀加入 25ml HAT 選擇培養(yǎng)液,混勻,接種
到 96 孔或 24 孔培養(yǎng)板,37℃ 5%CO 培養(yǎng) 12~24h。
3、 篩選:細胞融合后 12~24h,將細胞接種到 HAT 選擇培養(yǎng)液中,細胞密度達到 60~80%
匯合率之間,容許細胞進一步生長,進行異核體篩選,4~14 天后可觀察到大集落的雜
交瘤細胞克隆。
結果:一般培養(yǎng) 3~5 天后即可見小克隆出現(xiàn),雜交細胞,呈圓形且透明,其他細胞透
光性差并逐漸死亡。當培養(yǎng) 8~12 天后,克隆可長至孔底面積的 30~50%,此時可取培養(yǎng)
上清液進行抗體檢測。一旦檢測到分泌預定抗體的克隆,應及時將陽性克隆轉種 24 孔培養(yǎng)
板進行擴大培養(yǎng)。
注意事項:
1、應注意無菌操作,避免被微生物污染。
2、 如需 HAT 選擇系列產品,可選擇 Leagene A Media Supplement(50×)、HT Media
Supplement(50×)、HAT Media Supplement(50×)。
電誘導細胞融合試劑盒的操作步驟