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上海信帆生物 :TUNEL檢測(cè)選擇指南

更新時(shí)間:2016-06-06   點(diǎn)擊次數(shù):912次

細(xì)胞凋亡一直都是細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn),這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程涉及多條通路,可以用多種方法在不同的階段進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡晚期,細(xì)胞核發(fā)生形態(tài)變化、染色質(zhì)凝聚、核膜降解、DNA片段化。
TUNEL(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法)是檢測(cè)DNA片段化的成熟方法,自1992年發(fā)表以來(lái)經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn),縱橫實(shí)驗(yàn)室逾20年,至今仍然是廣泛采用的凋亡檢測(cè)方法,這是因?yàn)門(mén)UNEL能夠與其他細(xì)胞學(xué)技術(shù)很好的契合。比如,使用TUNEL分析進(jìn)行凋亡研究有一個(gè)好處,研究人員在TUNEL法標(biāo)記細(xì)胞之后,在直接檢測(cè)和定位凋亡信號(hào)的同時(shí),還可以通過(guò)抗體在同一個(gè)樣本上檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)指標(biāo)。
TUNEL的基本原理:DNA斷裂時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將生物素或熒光素或digaoxin標(biāo)記的dUTP摻入到DNA的3'-末端,可通過(guò)一定的顯色系統(tǒng)使之顯示出來(lái)。過(guò)去,TUNEL算得上是個(gè)值得“用心摸索”的試劑盒,因?yàn)橛悬c(diǎn)技術(shù)難度。如今市場(chǎng)上的TUNEL檢測(cè)產(chǎn)品有了哪些改進(jìn)和新選擇呢? 
考慮通透性和標(biāo)記
TUNEL檢測(cè)的一個(gè)關(guān)鍵要素是把握好細(xì)胞透化的時(shí)間。透化的目的是通透細(xì)胞膜和核膜,通俗說(shuō)就是在膜上打孔,讓反應(yīng)試劑得以充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng),提高檢測(cè)效果。門(mén)開(kāi)小了大家俬不好進(jìn)場(chǎng),若透化不足可能檢測(cè)不到凋亡的特征,造成假陰性??砷_(kāi)孔太過(guò)又影響形態(tài),透化時(shí)間太長(zhǎng)還容易脫片。 
DNA的標(biāo)記是另一個(gè)重要的影響因素。標(biāo)記分子太大則不利于TdT將其摻入DNA片段。早期的分析中dUTP通常用生物素或熒光素標(biāo)記,由于熒光基團(tuán)的“大塊頭”,使得其標(biāo)記的dUTP摻入DNA的效率要低于預(yù)期。后來(lái)改進(jìn)為利用Br-dUTP來(lái)取代生物素或熒光素標(biāo)記的dUTP,因?yàn)殇宸肿颖葻晒馑亍⑸锼氐葮?biāo)記物要小得多,因此Br-dUTP更容易被摻入凋亡細(xì)胞的DNA片段中,再經(jīng)過(guò)Br-dUTP抗體識(shí)別、以及抗體上偶聯(lián)的生物素或熒光素放大或顯色,使得zui后的檢測(cè)信號(hào)也更強(qiáng)。但是,Br-dUTP要用抗體檢測(cè),要求嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆磻?yīng)條件。
更好的選擇是EdUTP,這種以炔烴基團(tuán)(一種小分子基團(tuán))修飾的dUTP比Br-dUTP更小,更容易被TdT摻入到DNA末端。更妙的是,EdUTP的檢測(cè)不需要經(jīng)過(guò)抗體,而是通過(guò)一步高度特異性的click反應(yīng)(一種銅催化的疊氮化物與炔烴之間的反應(yīng)),將摻入DNA的EdUTP上的炔烴基團(tuán),與疊氮化合物(偶聯(lián)生物素或熒光素)共價(jià)連接,再借助疊氮化物上的生物素或熒光標(biāo)記,可實(shí)現(xiàn)靈敏的TUNEL檢測(cè)。與BrdU抗體(分子量約為150 kDa)相比,這個(gè)疊氮化物的大小僅為1%(分子量<~1000 Da),通透性要好得多。 
click技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于疊氮化物和炔烴都是極小的惰性基團(tuán),因此,只需要溫和的固定和透化條件,即可達(dá)到讓試劑充分滲透進(jìn)入細(xì)胞核。同時(shí),高度特異的click反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)更低的背景干擾,和更穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物,從而更好地檢測(cè)凋亡細(xì)胞。此外,升級(jí)版的Click-iT Plus技術(shù)無(wú)需銅的參與,染料兼容性更廣泛,在多色檢測(cè)中表現(xiàn)更出色。

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