上海信帆生物：測序方法大比拼
更新時間：2016-05-18 點(diǎn)擊次數(shù)：956次生物通報道：多細(xì)胞生物的每個細(xì)胞都攜帶著相同的遺傳學(xué)信息。不過，近年來蓬勃發(fā)展的單細(xì)胞研究告訴我們，每一個細(xì)胞都是*的。不同類型的細(xì)胞激活特定組合的機(jī)制，即使是同類型細(xì)胞，基因表達(dá)也會出現(xiàn)差異。
那么，細(xì)胞之間的哪些差異有生物學(xué)意義，哪些差異來自于技術(shù)偏好呢？要獲得可靠的結(jié)果又需要研究多少細(xì)胞呢？這些問題曾經(jīng)是單細(xì)胞研究（尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究）的攔路虎，令人望而卻步。單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析工具在這方面為人們提供了很大的幫助。
The Scientist雜志zui近了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專家，請他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫，處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。
上接：單細(xì)胞研究指南：細(xì)胞分離
測序方法大比拼
在單細(xì)胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，很少有人對這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enardzui近領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊，在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一個具有里程碑意義的重要技術(shù)。實際上，能夠從單細(xì)胞生成全長cDNA的測序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。對于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來說，覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去，儀器就會分離并裂解細(xì)胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來測序，也可以進(jìn)行qPCR檢測。
了解Fluidigm的C1單細(xì)胞自動制備系統(tǒng)的更多信息
在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seqzui為靈敏，成本也zui高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用，不過這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實健康單細(xì)胞的存在。
斯坦福大學(xué)的學(xué)者Stephen Quake及其團(tuán)隊利用Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)，對人類大腦皮層的482個單細(xì)胞進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序，zui終得到了466個單細(xì)胞的RNA測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表明，單細(xì)胞測序結(jié)果不但能用于區(qū)分神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及血管細(xì)胞，還能將神經(jīng)元分為五類興奮性細(xì)胞和兩類抑制性細(xì)胞。（更多信息請參見：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，繪制人腦細(xì)胞圖譜）
CEL-seq
CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一種采用線性擴(kuò)增的常用測序方法。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢是錯誤率比較低，不過線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年，主要是分離單細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細(xì)胞來源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫花費(fèi)的時間要稍微長一點(diǎn)。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合，大大減少了手動操作的時間。PCR是在zui后階段使用的，主要是為了連接正確的測序接頭，CEL-seq紐約大學(xué)的Itai Yanai介紹到。
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