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上海信帆生物:測序方法大比拼

更新時間:2016-05-18   點(diǎn)擊次數(shù):956次

生物通報道:多細(xì)胞生物的每個細(xì)胞都攜帶著相同的遺傳學(xué)信息。不過,近年來蓬勃發(fā)展的單細(xì)胞研究告訴我們,每一個細(xì)胞都是*的。不同類型的細(xì)胞激活特定組合的機(jī)制,即使是同類型細(xì)胞,基因表達(dá)也會出現(xiàn)差異。

那么,細(xì)胞之間的哪些差異有生物學(xué)意義,哪些差異來自于技術(shù)偏好呢?要獲得可靠的結(jié)果又需要研究多少細(xì)胞呢?這些問題曾經(jīng)是單細(xì)胞研究(尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究)的攔路虎,令人望而卻步。單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析工具在這方面為人們提供了很大的幫助。

The Scientist雜志zui近了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專家,請他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫,處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。

上接:單細(xì)胞研究指南:細(xì)胞分離

測序方法大比拼

在單細(xì)胞研究的大潮中,新的測序方法層出不窮。不過,很少有人對這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enardzui近領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊,在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測序方法,包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。

Smart-seq

SMART(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)是一個具有里程碑意義的重要技術(shù)。實際上,能夠從單細(xì)胞生成全長cDNA的測序方案并不多,Smart-seq就是其中之一。對于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來說,覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。

Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去,儀器就會分離并裂解細(xì)胞,把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來測序,也可以進(jìn)行qPCR檢測。

                        了解Fluidigm的C1單細(xì)胞自動制備系統(tǒng)的更多信息

在Enard的比較研究中,F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seqzui為靈敏,成本也zui高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用,不過這種芯片可以放到顯微鏡下觀察,證實健康單細(xì)胞的存在。

斯坦福大學(xué)的學(xué)者Stephen Quake及其團(tuán)隊利用Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng),對人類大腦皮層的482個單細(xì)胞進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序,zui終得到了466個單細(xì)胞的RNA測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表明,單細(xì)胞測序結(jié)果不但能用于區(qū)分神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及血管細(xì)胞,還能將神經(jīng)元分為五類興奮性細(xì)胞和兩類抑制性細(xì)胞。(更多信息請參見:單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序,繪制人腦細(xì)胞圖譜)

CEL-seq

CEL-seq(Cell expression by linear amplification and sequencing)是一種采用線性擴(kuò)增的常用測序方法。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢是錯誤率比較低,不過線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好。

CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年,主要是分離單細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段,給它們貼上代表其細(xì)胞來源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。

CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫花費(fèi)的時間要稍微長一點(diǎn)。不過,CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合,大大減少了手動操作的時間。PCR是在zui后階段使用的,主要是為了連接正確的測序接頭,CEL-seq紐約大學(xué)的Itai Yanai介紹到。

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