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上海信帆生物:免疫組化問題及解決辦法
更新時間:2016-05-12 點擊次數(shù):1540次1、染色過強
原因 | 解決辦法 |
抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長 | 降低抗體滴度(一般指濃縮性抗體)抗體孵育時間:室溫1小時或4℃過夜 |
孵育溫度過高,孵育溫度超過37℃ | 一般室溫20-28℃ |
DAB顯色時間過長或DAB濃度過高 | 顯色時間不能超過5-10分鐘,以顯微鏡下觀察為準 |
2、非特異性背景染色
原因 | 解決辦法 |
操作過程中沖洗不充分 | 每步沖洗3×5 |
組織中含過氧化物酶未阻斷 | 可再配置新鮮3%H2O2封閉,孵育時間延長 |
組織中含內源性生物素 | 正常非免疫動物血清再封閉 |
血清蛋白封閉不充分 | 延長血清蛋白封閉時間 |
3、染色弱
原因 | 解決辦法 |
抗體濃度過低,孵育時間過短 | 提高抗體濃度,孵育時間不能少于60分鐘 |
試劑超過有效使用期 | 及時更換試劑 |
操作中,滴加試劑時緩沖液未瀝干,致使試劑稀釋 | 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液(但防止切片干燥) |
室溫太低,低于15℃ | 若室溫低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘(或4℃冰箱過夜) |
蛋白封閉過度 | 封閉時間不要超過10分鐘 |
4、染色陰性
原因 | 解決辦法 |
操作步驟錯誤 | 重新試驗,設立陽性對照 |
組織中無抗原 | 設立陽性對照片,以驗證實驗結果 |
一抗與二抗種屬連接錯誤 | 仔細確定一抗與二抗種屬無誤 |
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