上海信帆生物:單細(xì)胞凝膠電泳的操作流程與注意事項
更新時間:2016-04-20 點擊次數(shù):1670次單細(xì)胞凝膠電泳(又名彗星實驗)的操作流程主要包括單細(xì)胞懸液的制備、凝膠板制備、細(xì)胞裂解與解旋、電泳與中和、染色和觀察等步驟。本文總結(jié)了單細(xì)胞凝膠電泳操作步驟和注意事項,希望對初入實驗的同學(xué)有幫助。
1、分離制備單細(xì)胞懸液:
(1)體外培養(yǎng)的細(xì)胞株:用胰酶消化,zui后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞要計數(shù),具體的量我前邊已經(jīng)說過。
(2)體內(nèi)臟器細(xì)胞:處死動物,取出臟器,于hanks’液中制備成單個細(xì)胞懸液。
2、膠板制備:
(1)取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA,鋪于磨沙載玻片上,形成底膠。蓋玻片推勻,不能有氣泡,4度凝固5至8分鐘。
(2)水平取下蓋片,取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液(約400個細(xì)胞)混勻,立即鋪片,加上蓋玻片,4度凝固5至8分鐘。
3、細(xì)胞裂解與電泳:
(1)將制備好的膠板去掉蓋玻片后,浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中,在4℃下裂解2.5到3小時。
(2)取出膠板,用雙蒸水浸沒漂洗后放入電泳槽中,浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
(3)玻片水平放置陽附近,4℃電泳20到25分鐘(25V,300mA)??稍陔娪静壑車颖鶋K以保持低溫。
4、中和與染色:
(1)電泳結(jié)束,將膠板浸泡于中和液中,每次10分鐘,共中和3次,每次要更換中和液。zui后晾干。
(2)取出膠板,置于染色缸中,在2μg/ml的EB染色液中,暗處染色5到10分鐘。
(3)蒸餾水漂洗2次,每次5分鐘。
稍晾干,濾紙吸去多余水分,盡快在熒光顯微鏡下觀察。
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