植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟
更新時(shí)間:2024-01-15 點(diǎn)擊次數(shù):891次植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
植物組織在脅迫環(huán)境條件下會(huì)產(chǎn)生多種活性氧(ROS),ROS 活性非常大且極其不穩(wěn)定,因此 ROS 的檢測(cè)通常因其最終產(chǎn)物而定。超氧陰離子是活性氧的一種,屬于一種含氧自由基,能將 NBT(氮藍(lán)四唑)還原成不溶于水的藍(lán)色甲瓚化合物,從而定位組織中的超氧陰離子。
植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)根據(jù)上述基本原理也稱為 NBT 染色法,用于植物活組織中的超氧陰離子染色。一般應(yīng)用于較嫩的根尖、葉片等的整體染色,染色后有超氧陰離子聚集的部位呈藍(lán)色至深藍(lán)色。該產(chǎn)品僅用于科研領(lǐng)域,不用于臨床診斷或其他用途。
自備材料:
1、新鮮的植物葉片或根、自來水、蒸餾水、95%乙醇
2、超聲波、磁力攪拌器、電子天平、濾紙、照相機(jī)
操作步驟(僅供參考):
1、試劑準(zhǔn)備:將 50 mg NBT 加入到 100mL 磷酸緩沖液(pH 7.4) 中充分溶解,即得 NBT染色工作液,2-8℃避光保存,一月內(nèi)有效。注:如果較難溶解,可通過超聲、磁力攪拌等方法促溶。
2、樣本準(zhǔn)備:采集經(jīng)脅迫(例如重金屬)的采集植物幼苗或根尖,自來水稍洗凈,置于濾紙上吸干多余水分。
3、染色:將植物幼苗或根尖浸入 NBT 染色工作液中,常溫避光浸染 2~6 h,至陽性部位出現(xiàn)深藍(lán)色,其余部位為淡藍(lán)色或近無色或呈植物本身的顏色即可。(根據(jù)植物幼嫩程度。顯色程度調(diào)整染色時(shí)間)
4、脫色:用鑷子將植物幼苗或者葉片小心取出,浸入蒸餾水中來回漂洗 3~5 次,置于濾紙上吸干多余水分后,浸入 95%乙醇中 40℃處理 3~16 h,目的是脫去植株幼苗或者葉片本身的葉綠素或者淡藍(lán)色背景,處理期間可多次更換新鮮的 95%乙醇。
5、觀察:用鑷子取出植株幼苗或者葉片,浸入蒸餾水中來回漂洗 3~5 次,置于濾紙上吸干多余水分后,將樣本轉(zhuǎn)入適量 NBT 樣本保存液中浸泡 30 min 后,隨后可取出拍照。樣本可置于該溶液中常溫保存一周。
注意事項(xiàng):
1、NBT 染色工作液配制好以后需 2-8℃避光保存,一月內(nèi)使用。存放時(shí)間過久,會(huì)影響顯色。
2、因任何外在因素都可能刺激植物應(yīng)激產(chǎn)生超氧陰離子,因此植物樣本需要新鮮采集,并盡快完成染色。建議做陰性及陽性空白對(duì)照組。
3、樣本染色完成后盡快拍照保存結(jié)果。
4、染色和脫色步驟也可參考如下建議操作:組織放入染液中,抽真空,-0.1MPa 保持負(fù)壓20~30min,再于室溫下靜置染色 60min,棄染色液;加入 95%乙醇,于 70~80℃水浴鍋脫色,每隔 10min 換一次 95%乙醇,待樣品綠色全部褪去后可停止脫色。
5、為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟