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植物過氧化物酶(POD)檢測試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的計算

更新時間:2023-12-18   點擊次數(shù):183次

植物過氧化物酶(POD)檢測試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的計算

產(chǎn)品簡介:

過氧化物酶(peroxisome,POD)是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶,主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中,以鐵卟啉為輔基,可催化過氧化氫,氧化酚類和胺類化合物,具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用,該酶屬于細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶,研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理,為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。植物過氧化物酶(POD)檢測試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)檢測原理是以愈創(chuàng)木酚(又稱 2-甲氧基酚)作為底物,在酶促反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時間測定產(chǎn)物生成量的方法,于酶標(biāo)儀 470nm 處測定吸光度,以吸光度變化所需酶量進行計算,主要用于植物組織的裂解液或勻漿液、血清等樣品中內(nèi)源性的過氧化物酶活性,尤其適用于測定水果中過氧化物酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不適用于臨床診斷或其他用途。 

自備材料:

1、蒸餾水

2、研缽或勻漿器

3、離心管

4、低溫離心機

5、水浴鍋或恒溫箱

6、96 孔板、酶標(biāo)儀

操作步驟(僅供參考)

1、準(zhǔn)備樣品:

①植物樣品:取 0.5-1.0g 植物組織或水果中層果肉加入 4ml 預(yù)冷的 POD Lysis Buffer

研磨或勻漿,4℃ 10000g 離心 15~20min,留取上清液,即為 POD 粗提液,-20℃凍

存,用于過氧化物酶的測定。

②血漿、血清和尿液樣品:血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定,-20℃凍存,用于過氧化物酶的測定。

③細(xì)胞或組織樣品:取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液,如有必要用 POD Lysis Buffer 進行適當(dāng)勻漿,4℃ 10000g 離心 15~20min,留取上清液,即為 POD 粗提液,-20℃凍存,用于過氧化物酶的測定。

④高活性樣品:如果樣品中含有較高活性的過氧化物酶,可以使用 POD Lysis Buffer 進行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、配制 POD Assay Buffer 工作液:取適量的 POD 氧化劑和 POD Assay Buffer,按 POD氧化劑:POD Assay Buffer=1:14 混合,即為 POD Assay Buffer 工作液,即配即用,不宜久置。

3、POD 加樣:取 96 孔板,按照下表設(shè)置對照孔孔、測定孔,注意:對照孔、測定孔中為同一待測樣品,但對照孔中是提前加熱煮沸 5min 的樣品;溶液應(yīng)按照順序依次加入,并注意避免產(chǎn)生氣泡,如果樣品中的 POD 活性過高,可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進行測定,樣品的檢測最好能設(shè)置 2 平行孔,求平均值。

4、POD 測定:立即以酶標(biāo)儀,以對照孔為對照,測定 470nm 處測定孔的吸光度(測定 0);

37℃準(zhǔn)確孵育 3min 后,立即加入 5μl POD 終止液終止反應(yīng)(備選方案),以對照孔為對

照,以酶標(biāo)儀測定 470nm 處測定孔的吸光度(測定 1)。注意:加入 POD 終止液終止反

應(yīng)不是必須步驟,可 37℃準(zhǔn)確孵育 3min 后,以對照孔為對照,直接以酶標(biāo)儀測470nm 處測定孔的吸光度(測定 1)。

計算:

POD 活性單位的定義:在該實驗條件下,每 1min 吸光度變化 0.01 所需酶量為一個活

性單位。

組織樣本 POD(U)={(測定 1-測定 0)×VT}/(W×VS×0.01×t)

式中:測定 1=孵育 3min 后測定孔的吸光度值

測定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后測定孔的吸光度值

W=組織樣本的重量(g)

VT=提取酶液的總體積(ml)

VS=測定時所用酶液體積(ml)

t=反應(yīng)時間

液體樣本 POD(U)=(測定 1-測定 0)/(0.01×t)

式中:測定 1=孵育 3min 后測定孔的吸光度值

測定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后立即測定的測定孔吸光度值

t=反應(yīng)時間

注意事項:

1、 待測樣品中不能含有酶抑制劑,同時需避免反復(fù)凍融。

2、 POD 酶液提取時,注意低溫操作,防止酶活性。

3、 以煮沸的酶液為對照時,酶要充分失活。

4、 POD 氧化劑和 POD 終止液具有一定腐蝕性,請小心操作。

5、 POD 氧化劑易揮發(fā),請密閉保存,否則檢測效率下降。

6、 如果沒有酶標(biāo)儀,也可以使用普通的分光光度計測定,每次檢測指標(biāo)不宜過多,否則操作時間不一,有可能導(dǎo)致樣本間的差異。

7、 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期:6 個月有效;常溫運輸,4℃保存。


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