多酚氧化酶測(cè)試盒的粗酶液提取
更新時(shí)間:2023-12-11 點(diǎn)擊次數(shù):226次多酚氧化酶測(cè)試盒的粗酶液提取
(多酚氧化酶 Polyphenol Oxidase,PPO ,分光光度測(cè)定法)
一、測(cè)定原理:
多酚氧化酶能夠催化底物酚產(chǎn)生醌,后者在 420nm 處有特
征性光吸收。
二、測(cè)定意義:
PPO 主要存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是一種
含銅的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌,從而引起褐化,
與果蔬加工、茶葉品質(zhì)等密切相關(guān);同時(shí)酚類物質(zhì)對(duì)病原微生物
有抑制和殺傷作用,具有一定的抗病能力。
三、試劑盒組成(50T/24 樣):
四、自備儀器或用品:
可見光分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、
1cm 光徑比色皿、研缽、蒸餾水、冰。
五、粗酶液提取:
1、組織樣本:組織稱重(g):提取液體積(mL)為 1:5 或
1:10 的比例(例如取 0.2g 組織,加 1mL 提取液或 0.1g
組織加 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿;8000 轉(zhuǎn)/分鐘常溫
離心 10min(或 4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 10min 后取上清再 4000
轉(zhuǎn)/分鐘離心 10min),取上清待測(cè)(取部分上清液于 90℃
以上沸水浴中反應(yīng) 5min 作為除非處理的粗酶液上清)。
2、血清(漿)或果汁樣本:取血清(漿)或果汁體積(mL):
提取液體積(mL)為 1:4 或 1:9 的比例(例如取 0.2mL
血清(漿)或果汁加入 0.8mL 提取液,或者取 0.1mL 血
清(漿)或果汁加入 0.9mL 提取液),渦旋混勻抽提 1min;
8000 轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心 10min(或 4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 10min
后取上清再 4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 10min),取上清待測(cè)(取
出部分上清液于 90℃以上沸水浴中反應(yīng) 5min 作為除非
處理的粗酶液上清)。
3、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:可用稱重法或細(xì)胞計(jì)數(shù)法,詳情參考 注
意事項(xiàng) 。
八、注意事項(xiàng):
1、細(xì)菌或細(xì)胞樣本前處理:A:稱重法:提取時(shí)可以先取離心
管用萬分之一天平稱重,再收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),
1000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 5min 后棄上清,再次稱重,減去空離心
管重量,再按 2(mg):1000(μL)或 1(mg):1000(μL)
的比例加入提取液,超聲破碎(冰浴,功率 20%或 200W,
超聲 3s、間隔 10s,重復(fù) 30 次),8000 轉(zhuǎn)/分鐘 4℃離心
10min,取上清待測(cè),結(jié)果按照組織計(jì)算方法計(jì)算;B:細(xì)
胞個(gè)數(shù)法:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;
按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(10 4個(gè)):提取液體積為 500~1000:1
的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲
波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s、
間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000 轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心 10min,取
上清待測(cè)
2、粗酶液提取完,吸出一部分在 90℃以上水浴中煮沸 5min,
取出流水冷卻,作為對(duì)照管煮沸的上清用。
3、試劑一在使用前先混勻使其分散后,再吸取進(jìn)行提取。
4、本實(shí)驗(yàn)組織/細(xì)胞樣本用試劑一提取很重要,提取后的粗酶
液除了測(cè)定蛋白以外,不能用于測(cè)定其他指標(biāo),以防止產(chǎn)
生干擾。
多酚氧化酶測(cè)試盒的粗酶液提取