超微量 Ca +2Mg +2—ATP 酶測(cè)試盒的測(cè)定意義
更新時(shí)間:2023-12-08 點(diǎn)擊次數(shù):173次超微量 Ca +2Mg +2—ATP 酶測(cè)試盒的測(cè)定意義
(測(cè)紅細(xì)胞)
一、測(cè)定意義:
ATP 酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上,是生物膜
上的一種蛋白酶,它在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳
遞方面具有重要的作用,機(jī)體在缺氧及一些疾病狀態(tài)下,
此酶活力發(fā)生一系列改變。
二、測(cè)定原理:
ATP 酶可分解 ATP 生成 ADP 及無(wú)機(jī)磷,測(cè)定無(wú)機(jī)磷的
量可判斷 ATP 酶活力的高低。
三、試劑組成與配制:(試劑盒有效期 6 個(gè)月)
四、紅細(xì)胞的前處理:
1、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(見附錄)或血紅蛋白測(cè)定(試劑本所有售)。
2、紅細(xì)胞溶血液的制備:
a、壓積紅細(xì)胞溶血液的制備:取肝素抗凝全血,1000
轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,棄上層血清,留下層壓積紅
細(xì)胞,取一定量的壓積紅細(xì)胞,加 49 倍的雙蒸水,
例如取 5μL 的壓積紅細(xì)胞加入 245μL 雙蒸水中,混
勻,使其充分溶血,對(duì)光觀察直至溶液透亮。如果
預(yù)試結(jié)果太高,再將溶血液稀釋成不同濃度再進(jìn)行
預(yù)試后,再?zèng)Q定取樣濃度。
b、全血紅細(xì)胞溶血液的制備:取小鼠全血,輕輕搖勻,
取一定量的全血按照 1:
24 的體積比加 24 倍雙蒸水,
制成 25 倍稀釋的溶血液,例如取 5μL 的全血加雙蒸
水 120μL 充分混勻,制成 25 倍稀釋的溶血液。對(duì)光
觀察直至溶液透亮。如果預(yù)試結(jié)果太高,再將溶血
液稀釋成不同濃度再進(jìn)行預(yù)試后,再?zèng)Q定取樣濃度。
[注 1]:制備好的溶血液盡快進(jìn)行檢測(cè),否則易失活,
因而必須在所有的準(zhǔn)備工作做好以后再配制
溶血液。
[注 2]:用不完的抗凝全血 4℃可保存 2~3 天, -20℃
以下保存一周或者更長(zhǎng)時(shí)間。
[注 3]:不可用磷酸鹽緩沖液或含磷的試劑稀釋樣本。
[注 4]:預(yù)試結(jié)果將絕對(duì)吸光度值(測(cè)定管吸光度值—
對(duì)照管吸光度值)控制在 0.2 左右為宜。
附錄Ⅰ:紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法
紅細(xì)胞計(jì)數(shù)有以下三種方法,只需取其中一種即可以。
1、計(jì)數(shù)板直接紅細(xì)胞計(jì)數(shù):
①、紅細(xì)胞稀釋液的配制:檸檬酸三鈉 3.8 克,甲醛
1mL,雙蒸水 100mL,混勻,4℃保存。
②、取 1 支試管,加入紅細(xì)胞稀釋液 2mL,取抗凝全
血 10µl 加入試管稀釋液中,反復(fù)吹吸數(shù)次,
再將試管顛倒數(shù)次混勻。
③、取一滴稀釋血液灌入計(jì)數(shù)板。(應(yīng)一次灌滿,而且
不要灌得太多。)
④、用高倍鏡計(jì)數(shù)左上、左下、右上、右下,中央 5
個(gè)中方格的紅細(xì)胞數(shù),將數(shù)得的數(shù)字×10 10,
即為每升血中的紅細(xì)胞數(shù)。
2、光電比濁法計(jì)紅細(xì)胞數(shù):
取試管 1 支,加入上述紅細(xì)胞稀釋液 4mL,再
取 20µl 抗凝全血,加入 4mL 稀釋液中,反復(fù)吹吸數(shù)
次,再將試管顛倒數(shù)次混勻,立即倒入比色杯中,
于 540nm,1cm 光徑,雙蒸水調(diào)零進(jìn)行比色,記下
吸光度值。以計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞的數(shù)值為橫坐標(biāo),
以相應(yīng)管的吸光度值為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。您可
以不做曲線,用附錄Ⅱ參考標(biāo)準(zhǔn)曲線圖二(鼠紅細(xì)
胞數(shù)與比濁法吸光度換算曲線)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出
紅細(xì)胞數(shù)。
3、用血紅蛋白(Hb)來(lái)?yè)Q算紅細(xì)胞數(shù):
取 10µl 抗凝全血加入 2.5mL 血紅蛋白測(cè)試液
(本所有供應(yīng))中,混勻,靜置 10 分鐘,于 540nm,
1cm 光徑,雙蒸水調(diào)零進(jìn)行比色。將測(cè)得的吸光度
乘以 367.7 即為血紅蛋白的值。以計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的紅細(xì)
胞的數(shù)值為橫坐標(biāo),以相應(yīng)管的血紅蛋白數(shù)為縱坐
標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。您可以不做曲線,用附錄Ⅱ的參
考標(biāo)準(zhǔn)曲線圖一(鼠紅細(xì)胞數(shù)與血紅蛋白數(shù)的換算
曲線)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出紅細(xì)胞數(shù)。
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