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原位雜交的實驗操作步驟
更新時間:2023-10-16 點擊次數(shù):206次 原位雜交的實驗操作步驟
信帆生物提供原位雜交實驗檢測服務。操作步驟如下:
1.組織固定:組織取出PBS漂洗后立即放入原位雜交固定液(動物)中固定12h以上,4°保存運輸。
2.脫水:固定后在通風櫥內(nèi)切取目的區(qū)域組織塊約3mm厚,放入15%蔗糖溶液中8h,后換30%蔗糖溶液中過夜。
3.冰凍切片固定:冰凍切片室溫晾干,置于原位雜交固定液(動物)固定10min,于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
4.修復及消化:根據(jù)組織類型,固定時間長短及指標的定位,選用不同的修復液進行修復,具體修復條件見上表。自然冷卻后組化筆畫圈,根據(jù)不同組織不同指標特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化,消化時間見上表。純水沖洗后PBS洗3次,每次5min。
5.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
6.預雜交:滴加預雜交液,37°C孵育1h。
7.雜交:傾去預雜交液,滴加含探針雜交液, 恒溫箱雜交過夜。雜交條件見上表。
8.雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。
9. 滴加對應的分支探針雜交:輕輕甩干切片,滴加已預熱的相應的分支探針雜交液(見上表及附表)(60 μL),水平置于濕盒內(nèi)40℃雜交45 min。此過程中在濕盒底部加入50ml 2× SSC,防止干片。
10.雜交后洗滌:傾去雜交液,將切片依次用40°C預熱的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC于40°C漂洗5 min。注:若非特異性雜交體較多,可以在此步增加洗滌時間、次數(shù)及調(diào)整雜交液中甲酰胺濃度。
11. 滴加對應的信號探針:滴加含信號探針(見上表及附表)雜交液,稀釋比1:400.42°孵育3h。后依次經(jīng)過以下SSC洗滌:2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC 37°洗10min。
12.血清封閉:滴加封閉血清正常兔血清 室溫孵育30min。
13. 孵育HRP標記鼠抗-地-高-辛抗體(HRP-anti-DIG ):傾去血清封閉液,滴加HRP- anti-DIG。37°孵育50min,后PBS洗5min 4次。
14.DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色。
15.復染細胞核:蘇木素染液復染3min左右,自來水洗,蘇木素分化液分化數(shù)秒,自來水洗,蘇木素返藍液返藍1min,流水沖洗。
16.脫水封片:將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,將切片從二甲苯中拿出稍晾干后,封片劑封片。
結果判讀:陽性為棕黃色,細胞核為藍色。
送樣要求:
1、切片前處理要求:新鮮組織干冰運輸后做冰凍切片;或取2mm左右厚度的新鮮組織,5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,4℃低溫保存運輸,切勿冷凍結冰,盡快包埋切片后進行原位雜交實驗,固定時間過長影響核酸檢出率;
2、冰凍切片:冰凍切片-20℃運輸;
3、石蠟切片:石蠟切片常溫運輸;
4、細胞爬片:細胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,換無酶PBS,密封,4℃運輸。
原位雜交的實驗操作步驟