四種常見的ELISA方法您知道多少
更新時(shí)間:2023-08-22 點(diǎn)擊次數(shù):164次四種常見的ELISA方法您知道多少
1.直接ELISA
將抗原固定于ELISA板上,然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。
相較于其它類型的ELISA實(shí)驗(yàn),直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少,檢測速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反應(yīng),測定結(jié)果不容易出錯(cuò)。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與ELISA板結(jié)合,實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,實(shí)驗(yàn)不太靈活。另外由于沒有使用二抗,信號(hào)沒有被放大,降低了測定的靈敏度。
2.間接ELISA
先將抗原結(jié)合到ELISA板上,隨后分兩步進(jìn)行檢測:首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合,隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色。
與直接ELISA相比,間接ELISA用到酶標(biāo)二抗,具有更高的靈敏度,也需要更少的標(biāo)記抗體,更經(jīng)濟(jì)。間接ELISA還提供了更大的靈活性,因?yàn)椴煌囊豢鼓軌蚺c單一標(biāo)記的二抗一同使用。間接ELISA實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是存在交叉反應(yīng)的可能性(酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合),可能會(huì)增加背景,同時(shí)與直接ELISA相比,間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟,實(shí)驗(yàn)周期延長。
3.夾心ELISA
先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中,然后加入樣品,接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標(biāo)抗體,則可稱為直接夾心ELISA;如果檢測抗體不帶有標(biāo)記,則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合,這種稱為間接夾心ELISA。
夾心ELISA的靈敏度高,它比直接或間接ELISA敏感2-5倍;同時(shí)夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合,擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進(jìn)行檢測,靈活性較高。夾心ELISA的缺點(diǎn)是對(duì)配對(duì)抗體要求很高,如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對(duì)抗體,則需要進(jìn)行配對(duì)抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化,因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。
4.競爭ELISA法
預(yù)先將抗原包被在固相載體上,并加入酶標(biāo)記的特異性抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí),加入待檢抗原(或抗體),如果待檢物是抗原,則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體;如果待檢測物是抗體,則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標(biāo)抗體,最后加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。
競爭ELISA相對(duì)以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些,但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可檢測不純的樣品,且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,但存在整體敏感性和專一性較差的問題。
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